柠檬酸裂解酶 甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(11): 2024−2033

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02024

甘蔗ATP 柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

李长宁1,2 农 倩1 谭秦亮1 Manoj Kumar SRIVASTAVA 2 杨丽涛1,2,* 李杨瑞1,2,*

1

广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁530005; 2中国农业科学院甘蔗研究中心 / 农业部广

西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西作物遗传改良生物技术重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西南宁530007

摘 要: ATP 柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶A 合成途径的关键调控酶, 在生物体正常生长发育中有重要作用。本研究通过Race 和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL 蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1, 其编码框长度分别为1 272 bp和1 827 bp, 编码423个和608个氨基酸, 推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性, 都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在ATP-grasp 功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP 结合、CoA 结合、磷酸化区域等, 序列高度保守。实时荧光定量PCR 结果表明, 2个基因均受外源ABA 、水分胁迫、水分胁迫加ABA 处理诱导表达, 且叶中表达量显著高于根系, 其中又以水分胁迫处理下的表达量最高, 2个基因表现出协同表达模式。SoACLA-1和SoACLB-1的表达与ABA 、ROS 含量具有相关性, 说明它们可能参与了ABA 调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。

关键词: 甘蔗; ATP柠檬酸裂解酶; 克隆; 脱落酸; 表达

Cloning and Expression Analysis of ATP-Citrate Lyase Genes from Sugarcane

LI Chang-Ning1,2, NONG Qian1, TAN Qin-Liang1, Manoj Kumar SRIVASTAVA 2, YANG Li-Tao1,2,*, and LI Yang-Rui 1,2,*

1

Agricultural College / State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, Guangxi University, Nanning 530005,

China; 2 Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improve-ment (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory / Guangxi Key Laboratory of Sugar-cane Genetic Improvement, Nanning 530007, China

Abstract: Acetyl-CoA plays an important role in the cytosol of plant cells for the synthesis of a diverse set of phytochemicals, and the cytosolic acetyl-CoA is from the reaction of citrate and CoA catalyzed by ATP-citrate lyase (ACL) coupled with the hydrolysis of ATP. In this study, two genes encoding two distinct subunits of ACL were identified from sugarcane (Saccharum officinarum) by RACE and insilico cloning technigues, named SoACLA-1 and SoACLB-1, which contained 1272 and 1827 bp open reading frames, and encoded 423 and 608 amino acids, respectively. Sequence analysis indicated that both amino acids sequences showed high homology with ACLs from other species and were close clustered with ACLs from gramineous plants in the phylogenetic tree constructed by MEGA5.0 software using a Neighborhood-Joining bootstrap method. Both sequences showed high conserva-tion in the ATP-grasp domain, citrate binding site, active binding site of histidine phosphorylated by ATP, potential ATP-binding, phosphorylated site and CoA-binding site when compared with ACLs from other species. Quantitative real-time PCR results indi-cated that SoACLA-1 and SoACLB-1 were both induced by the treatment of control+ABA, water stress, water stress +ABA, and their expression levels were higher in leaves than in roots, with the highest express level in water stress treatment, SoACLA-1 and SoACLB-1 showed a synergetic expression pattern. The expression of SoACLA-1 and SoACLB-1 was close correlated with the ABA and ROS contents, indicating that ACL maybe involved in stress responsive metabolic process triggered by ABA in plants. Keywords: Sugarcane; ATP-citrate lyase; Cloning; ABA; Expression

本研究由广西自然科学基金创新团队项目(2011GXNSFF018002), 国家国际合作项目(2008DFA30600, 2009DFA30820), 广西科技攻关项目(桂科能0815011, 桂科产1123008-1) 和广西农业科学院创新团队项目(桂农科2011YT01) 资助。

*

通讯作者(Corresponding authors): 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net; 杨丽涛, E-mail: litaoyang61@yahoo.com

第一作者联系方式: E-mail: lcn560@163.com

Received(收稿日期): 2012-04-27; Accepted(接受日期): 2012-07-05; Published online(网络出版日期): 2012-09-10. URL: /11.1809.S.20120910.1345.010.html

第11期

李长宁等: 甘蔗ATP 柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2025

乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)作为关键的代谢中间产物联结着至少5个亚细胞单位中的生理生化进程, 在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。质体中, acetyl-CoA 为脂肪酸[1]和硫代葡萄糖苷[2]等的合成前体; 线粒体中acetyl-CoA 与三羧酸循环(TCA)偶联, 合成ATP 和氨基酸骨架; 微体中acetyl-CoA 主要来自脂肪酸β-氧化, 可作为能量来源; 细胞核和胞质中acetyl-CoA 作为乙酰基供体参与组蛋白和转录因子甲基化修饰, 在真核生物的染色体结构调节和基因表达调控中发挥重要作用[3-5]。此外, 胞质acetyl-CoA 可通过羧化、缩合和乙酰化作用, 参与众多物质合成, 调节生物体各项生理活动[6-8]。有报道证实, 胞质acetyl-CoA 对玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae ) 有性和无性世代的转换有影响[9]。

由于acetyl-CoA 不能自由通过细胞质膜, 因此, 它的产生和积累在各细胞器中独立进行, 但又不能完全割裂[10-12], 如胞质代谢中, ATP柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase, ACL)催化柠檬酸和CoA 生成草酰乙酸和acetyl-CoA, 而柠檬酸为线粒体内TCA 循环中间产物且通过线粒体膜上的载体向胞质中转运供应, ACL活性强弱对胞质acetyl-CoA 积累至关重要。研究表明, ACL有同聚肽(homomeric)和杂聚肽(heteromeric) 2种结构, 在一些菌类和哺乳动物中ACL 由单个基因编码, 其余生物体中则分别由不同基因编码的A (ACLA)和B (ACLB) 2个亚基组成[13]。拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtACLA由AtACLA-1、AtACLA-2和AtACLA-3基因编码, 且都位于第1染色体上; AtACLB则由AtACLB-1和AtACLB-2基因编码, 前者位于第3而后者位于第5染色体上[13]。拟南芥ACL 是一种A 4B 4结构的异源八聚体蛋白, AtACLA 和AtACLB 分子量约为45 kD和65 kD, 全蛋白分子量约为500 kD, 研究证实, 通过ACL 催化生成, 是胞质中acetyl-CoA 来源唯一途径[13]。拟南芥AtACLA-1反向遗传转化研究表明, 其活性的抑制可导致植株微型化、细胞体积缩小、质体畸形、叶片表面蜡质沉积和脂肪酸含量减少, 淀粉、花青素超量积累, ACLA和ACLB 表达量和ACL 活性降低, 表型变化程度与ACL 抑制程度正相关, 并引起相关胁迫基因的响应[14], 这表明ACL 对植物正常生长发育必不可少, 并在应对逆境胁迫反应中发挥重要作用。

近年来, 对植物ACL 的研究, 集中在其活性与油脂积累的关系[15-17], 而对植物激素、逆境胁迫条

件下该基因的应答研究鲜见报道。作为重要的糖料作物, 对甘蔗代谢调控的研究越来越多[18-20], 然而对甘蔗ACL 基因目前尚无报道, 本研究拟克隆编码甘蔗(Saccharum officinarum) ACL 两个亚基的基因, 并探索其的进化保守性和表达特性, 为进一步研究该酶的调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

选用甘蔗品种桂糖21 (GT21), 将蔗种以单芽方式种植于泥沙混合培养基质上, 3周后, 选取长势一致植株移栽至含Hoagland 营养液的桶中(pH 6.0), 桶规格约为21 cm × 19 cm (直径×高), 每桶盛5 L营养液且每3 d更换一次, 为防止根系缺氧, 使用充气泵每隔1 h充气一次, 每次10 min, 待长势恢复后进行处理, 分别设: 对照(control, C); 对照+ABA (con-trol+ABA, CA, 叶面喷施100 μmol L–1 ABA); 水分胁迫[water stress, WS, 营养液中含25% (M/V) 的PEG-6000]; 水分胁迫+ABA (WS+ABA, WSA, 干旱处理同时叶面喷施100 μmol L–1 ABA)。喷施至叶面湿透无滴水, 在处理后的0、3、6、9、12和24 h采集叶样(+1叶) 和幼嫩根系分装速冻于液氮中, 于–80℃冰箱中保存用于后续试验。

1.2 测定项目与方法

采用酶联免疫吸附法测定甘蔗内源脱落酸(ABA)含量, 试剂盒购于中国农业大学, 按其说明书操作; 使用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基

(O &−2

) 产生速率[21]

; 使用Trizol (Invitrogen)试剂提取甘蔗总RNA; 使用Formentas (K1622)和Clontech (634923)公司试剂盒合成cDNA 第一链, 产物分别用于实时荧光定量PCR 和基因全长获取。 1.2.1 SoACL 扩增 以NCBI 中与拟南芥AtACLA-1相似性极高的甘蔗EST 序列(CA185038)为模板, 设计引物F: 5′-GGCTCCAATCACGACC TTC-3′和R: 5′-TGCTGCCCAACCTTTCTG-3′, 分别结合RACE (Clontech)试剂盒提供的接头引物UPM, 通过3′-及5′-RACE PCR反应以获得SoACLA-1的3′-和5′-末端序列。反应体系含2×GoldStar Best MasterMix (康为世纪, 北京) 25 μL 、cDNA 2 μL 、10 μmol L–1正反向引物各1 μL 、以ddH 2O 补齐50 μL 。反应程序为95℃预变性10 min; 95℃变性30 s; 60℃退火30 s; 72℃延伸2 min, 36个循环; 72℃最后延伸10 min。3′-和5′-RACE 产物经拼接后, 在其编码框

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作 物 学 报 第38卷

首尾设计引物F: 5′-ATGGCGCGCAAGAAGATCC-3′和R: 5′-TTATGCTGCAGCCATGATGC-3′进行扩增以验证序列准确性。采用电子克隆方法获得甘蔗SoACLB-1基因完整编码框, 重叠群(contig)判断标准为序列间重叠碱基数大于40且相似性大于95%。拼接所用EST 为CA069900、CA071659、CA073108、CA075867、CA078429、CA078959、CA086717、CA098387、CA098982、CA109515、CA121969、CA155678、CA155967、CA156105、CA156346、CA156371、CA157078、CA157261、CA170609、CA173000、CA173286、CA175436、CA177470、CA178822、CA187240、CA189917、CA195483、CA199862、CA202864、CA205030、CA213250、CA214346、CA219929、CA220789、CA223821、CA231005、CA234164、CA238314、CA241410、CA243668、CA248206、CA251812、CA253200、CA256249、CA258755、CA259445、CA262645、CA269073、CA284753和CA289719, 拼接完毕后, 在其首尾处设计引物F: 5′-ATGGCAACTGGCCAA CTTTTT-3′和R: 5′-TCACTTGGTGTACAGGACAT CCTC-3′进行扩增验证序列准确性, 反应体系和程序同上。回收、纯化所有PCR 产物, 连接pMD18-T 载体(TaKaRa)后转化DH5α (Trans Gen)感受态细胞, 筛选阳性克隆, 提取质粒DNA 验证后, 由生工生物工程(上海) 公司测序。

1.2.2 生物信息学分析 选用BlastP 搜索蛋白质相似性; 由ExPASy (https://expasy.org/tools/)分析蛋白质基本理化性质; 由MEGA5.0程序(https://www. megasoftware.net/)分析系统进化树; 使用ClustalW2程序 (.uk/Tools/clustalw2/index.html)进行蛋白质多序列比对并通过Espript (https://espript.

ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行渲染; 通过NCBI CDD (conserved domain databases)数据库分析蛋白质保守结构域。

1.2.3 实时荧光定量PCR 以甘蔗GAPDH 基因(EF189713)为内参, 其引物序列为F: 5′-TGGTG CTGACTATGTCGTGGA-3′, R: 5′-CATGGGTGCAT

CTTTGCTTG-3′; SoACLA-1引物为上述3′-和5′-RACE PCR引物组合; SoACLB-1扩增引物为F: 5′-CCCGTTTCGGTGGAGCAAT-3′, R: 5′-GGCGTG AGGTTCCTGTCA-3′。反应体系含10 μL 2×All-in- One qPCR Mix (Gene Copoeia)、2 μL cDNA、4 μmol L –1的正反向引物各1 μL 、6 μL 双蒸水。程序为95℃预变性10 min; 95℃变性10 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸20 s, 40个循环。反应完成后进行融解曲线检验, 采用2−ΔΔCt 法计算相对表达量。相同处理时间内的指标用DPS 软件以Duncan’s新复极差法(P ≤0.05) 检验各处理平均数差异显著性。

2 结果与分析

2.1 SoACL 基因克隆

测序结果表明, SoACLA-1基因3′-和5′-RACE 产物长度分别为1 223 bp (图1-A) 和533 bp (图1-B), 除去接头引物及重叠序列后, SoACLA-1全长cDNA 为1 594 bp, 其5′末端包含起始密码子且符合Kozak 法则, 3′末端具典型poly (A)加尾信号, 包含长度为1 272 bp (图1-C) 的开放阅读框, 编码423个氨基酸, 5′和3′端非翻译区长度为95 bp和227 bp, 将该基因在NCBI 上注册, 获得登录号JQ292843。SoACLB-1开放阅读框为1 827 bp (图1-D), 经测序与电子克隆获得的SoACLB-1序列相比, 二者长度一致, 编码的608个氨基酸100%吻合, 证实电子克隆结果真实可

图1 甘蔗SoACL 基因扩增产物电泳图

Fig.1 Electrophoresis results of amplified products of SoACL genes

A~B: SoACLA-1 3′-和5′-RACE 扩增结果; C~D: SoACLA-1和SoACLB-1编码框扩增结果。

A and B: 3′- and 5′-RACE amplified results of SoACLA-1; C and D: open reading frame amplified results of SoACLA-1 and SoACLB-1.

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靠, 该基因经注册获得登录号为JQ923438。 别为5.67和7.54。疏水性预测发现, SoACLA-1第338位甘氨酸疏水性最强, 分值最低的是第7和第9位的精氨酸和络氨酸; SoACLB-1第406位的半胱氨酸疏水性最强, 最弱的是第495位的天冬酰胺。2

种蛋白平均亲水系数分别为–0.119和–0.040。ACL 多序列比对结果表明(图2), 在ATP-grasp 功能域保守氨基酸残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点,

2.2 蛋白序列生物信息学分析

BlastP 比对结果表明, SoACLA-1和SoACLB-1与AtACLA-1和AtACLB-1的一致性/相似性分别为81%/91%和93%/98%, 均分别高于与拟南芥其他家族成员相比的百分数。Expasy 工具分析显示, 2种蛋白预测分子量分别为46.7 kD和66.0 kD, 等电点分

图2 ACL蛋白序列多重比对

Fig. 2 Sequence alignment of ACL proteins

利用ClustalW2进行氨基酸序列比对, 以PDB 数据库HsACL 为二级结构模板通过ESPript 渲染, 深色背景表示一致序列。下标箭头、菱形和三角形的氨基酸分别为ATP-grasp 功能域保守残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点, 下标i 、ii 、iii 的下画线区域分别代表ATP 结合、磷酸化和CoA 结合区域。

SoACL is aligned with ACL proteins from Homo sapiens (Hs) and Arabidopsis thaliana (At). Alignment is performed using ClustalW2 and color with ESPript, and dark backgrounds represent identical sequences. The arrows, diamond, and triangles below the residues show identity for conserved in the ATP-grasp domain, citrate binding, and active site, respectively, with His phosphorylated by ATP; underline subscripted

by i, ii, and iii indicate potential ATP-binding, phosphorylated, and CoA-binding sites, respectively.

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作 物 学 报 第38卷

ATP 结合区域、磷酸化区域和CoA 结合区域等, 序列均高度保守, 其余序列相似性也极高。比较有趣的是, 蛋白为杂聚肽结构的拟南芥和甘蔗ACL 与同聚肽结构人(Homo sapiens) 的ACL 相比, A亚基和B 亚基间比人的ACL 缺省60个氨基酸残基。

进化关系分析的聚类结果表明(图3), 杂聚肽结构ACL 蛋白的A 亚基和B 亚基分别聚于一大类, 同聚肽结构的ACL 聚于另一大类。SoACLA-1与同属C 4植物的玉米(Zea mays) 的ZmACLA 聚于同一个小的进化分支, 且与同属禾本科植物的高粱(Sorghum

bicolor ), 水稻(Oryza sativa) 和二穗短柄草(Brachy- podium distachyon) 的ACLA 进化关系也较近。SoACLB-1具有与SoACLA-1类似的聚类关系。

&产生速率和ABA 含量变化 2.3 O −2

CA 、WS 、WSA 处理均导致甘蔗叶片及根系超

&) 产生速率显著上升(图4), 但氧阴离子自由基(O −2&趋势有所不同。在叶中(图4-A), CA处理在12 h O −2

产生速率达到极值, 24 h后有所下降, 可仍比对照高

&产生速率在处理期间一直

出37.1%, WS处理的O −2

图3 ACL蛋白系统发生树

Fig. 3 Phylogenetic tree of ACL proteins

分支上的数字表示Bootstrap 验证中该分支可信度百分比, 蛋白名称前2位为物种缩写, 全称见英文注释, 括号内为登录号。 The numeric values in each node represent percentage of homology amongst ACLs verified by bootstrap, the accession number of each pro-tein is listed in the packet, and first two characters before the protein names indicate abpeviations of species as follows: Ac: Aspergillus clavatus ; Ag: Anopheles gambiae; Am: Ailuropoda melanoleuca; Ao: Aspergillus oryzae; Ap: Acyrthosiphon pisum; At: Arabidopsis thaliana; Bd: Brachypodium distachyon; Ci: Ciona intestinalis; Co: Capsaspora owczarzaki; Cp: Cavia porcellus; Cr: Chlamydomonas reinhardtii; Cs: Camellia sinensis; Dd: Dictyostelium discoideum; Dg: Drosophila grimshawi; Dm: Drosophila melanogaster; Dp: Dictyostelium purpureum; Ec: Equus caballus; Gm: Glycine max; Gu: Glycyrrhiza uralensis; Hs: Homo sapiens; La: Lupinus albus; Mb: Monosiga pevicollis; Mm: Mus musculus ; Mr: Megachile rotundata; Mt: Medicago truncatula; Oa: Ovis aries; Os: Oryza sativa; Ps: Picea sitchensis; Rc: Ricinus communis; Rn: Rattus norvegicus; Sb: Sorghum bicolor; Sm: Selaginella moellendorffii; So: Saccharum officinarum; Sp: Schizosaccharomyces pombe;

Ss: Sus scrofa; Ta: Thermovipio ammonificans; Tc: Tribolium castaneum; Vv: Vitis vinifera; Xt: Xenopus tropicalis; Zm: Zea mays.

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李长宁等: 甘蔗ATP 柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2029

呈上升趋势, 在24 h比对照高出82.4%, WSA处理在各取样时间段都比对照显著提高, 但低于同期

−&&产生速率; 在根中, CA处理6 h后O 2WS 处理的O −2

CA 、WS 和WSA 处理均显著提高甘蔗叶片(图4-C) 和根系(图4-D) 的ABA 含量。CA 处理的叶片ABA 含量在12 h达极值, 根系在6 h达极值后呈下降趋势; WS和WSA 处理的ABA 含量变化趋势相对一致, 均随着胁迫时间延长含量逐渐升高, 叶片中WS 及WSA 处理ABA 含量均在处理9 h达到极值; 根系中, 2个处理均在12 h达到极值, 24 h内保持稳定。

产生速率达到极值, 后随时间推移而下降(图4-B); WS 处理在各取样时间点分别比对照增加87.3%、113%、119.5%、138.8%和149.8%, WSA处理分别增加80.5%、98.1%、105.6%、117.3%和128.1%。

&产生速率及ABA 含量变化 图4 不同处理条件下甘蔗叶片(A, C)和根系(B, D)中O -2

-& producing rate and ABA content in leaves (A, C) and roots (B, D) of sugarcane seedlings under different treatments Fig. 4 O 2

相同处理时间内, 标有不同字母的处理间在0.05水平差异显著。

Bars superscripted by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same time of different treatments.

2.4 SoACL 表达分析

由图5可知, 甘蔗叶片及根系中SoACLA-1和SoACLB-1基因均受到CA 、WS 、WSA 处理的诱导使表达量升高, 但叶片中2个基因表达量均远高于同处理条件下根系的表达量。叶片中, CA、WSA 处理下2个基因表达量均在9 h达极值, WS处理在12 h 达最大值, 后表达量均比最大值有所下降; 根系

中, 3个处理条件下2个基因表达量最大值均出现在处理12 h。不同处理条件下, 叶片及根系中2个基因表达极值均出现在WS 处理12 h, 此时叶中SoACLA-1和SoACLB-1表达量分别是对照的16.53倍和17.12倍, 根中表达量分别是对照3.89倍和3.92倍。相同部位和处理下2个基因表达量并无明显差异。

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作 物 学 报 第38卷

图5 不同处理条件下甘蔗叶片(A, B)和根系(C, D)中SoACL 表达量变化

Fig. 5 Changes of SoACL expression in leaves (A, B) and roots (C, D) of sugarcane seedlings under different treatments 相同处理时间内, 标有不同字母的处理间在0.05水平差异显著。

Bars superscripted by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same time of different treatment.

3 讨论

ATP 柠檬酸裂解酶(ACL)作为催化细胞质中acetyl-CoA 合成的关键调控酶, 在生物体的正常生长发育中发挥着重要的作用[5,9,14]。本研究通过RACE 和电子克隆得到编码甘蔗ACL 蛋白的2个亚基基因SoACLA-1和SoACLB-1。序列分析表明, 它们拥有完整的编码框, 所编码蛋白与其他物种相比, 在重要的功能域区间如底物结合位点和磷酸化位点等, 序列均高度保守, 显示所获得基因序列的准确性和该基因进化保守性。由于甘蔗和拟南芥ACL 同属杂聚肽结构, 而人(Homo sapiens) 等哺乳动物的ACL 属于同聚肽结构, 多序列比对时, 杂聚肽ACL 两个亚基间比同聚肽ACL 缺省60个氨基酸残基, 据推测与动物界的进化史早期发生ACLA 与ACLB 基因的融合有关[13]。

ABA 影响着植物众多基因的转录调控[22-23]。本研究结果表明, 甘蔗SoACLA-1和SoACLB-1基因均受CA 、WS 及WSA 处理诱导使表达量上升。逆境胁迫下植物体内的ABA 含量会增加, 外施ABA 处理能进一步提高内源ABA 的含量, 正常条件下, 外施ABA 处理亦会使植物内源ABA 含量上升[24]。本研究结果表明, 相同处理期内, CA、WS 的ABA 含量均高于对照, WSA处理的含量高于前述2个处理, 证实了Ye 等[24]的研究结果。ACL 与植物倍半萜[25]和类胡萝卜素[26]的合成密切相关, ABA本身就是一种具有倍半萜结构的植物激素, 而类胡萝卜素为ABA 合成的重要前体物质, 但ACL 活性与ABA 合成是否存在定量关系, 还需进一步研究证实, 在本研究中WSA 的ABA 含量高于同期WS 处理, 但ACL 的表达量并不存在上述的对应关系。

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李长宁等: 甘蔗ATP 柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2031

植物代谢过程中活性氧(ROS)的产生不可避免, 生物及非生物胁迫常导致细胞ROS 含量急剧上 升

[27]

。本研究结果显示, WS

处理的O &−2

产生速率显著高于对照, 证实了前人的研究, ROS作为重要的第2信使, 在ABA 信号传导中扮演重要角色, 这可

能是CA 处理O &−2

产生速率高于对照的原因。已有研究表明, 逆境胁迫下外源ABA 能提高植物抗氧化防护系统相关酶的活性, 加强ROS 清除能力[28], 从而

导致WSA 的O &−2

产生速率低于WS 处理。TCA 循环中的顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等在遭受ROS 攻击时活性会降低[29-30], 导致柠檬酸在线粒体中的积累并促使其加速向细胞质中转运[31], 底物的增加使胞质中ACL 活性提高[32], 加快柠檬酸的分解以满足下游物质合成对底物的需求。

本研究结果表明, WS处理的O &−2

产生速率均高于其余2个处理, 与此对应的是SoACL 的表达量亦高于2个处理, 证实ROS 与ACL 的密切关系。

此外, ACL还与根系分泌物相关。研究证实, 在可吸收无机离子缺乏的土壤环境中, 植物根系可向外分泌羧化物作为有机螯合剂去活化难溶离子, 促进植物对它们的吸收利用, 柔嫩及成熟根系分别以分泌苹果酸盐和柠檬酸盐为主[33-34], ACL催化产物草酰乙酸为苹果酸合成的重要底物。水分胁迫会致使根系细胞的水势降低, 导致吸收困难, ACL活性提高将加速草酰乙酸积累并提高苹果酸的合成, 有助于根系分泌物增加, 利于根系对无机离子的吸收以维持植物体正常生长的需要。研究证实, ACL催化产物草酰乙酸和ADP 对其催化反应存在反馈调节机制

[35]

, 这可能是ACL 在达到表达极值后表达量

随之减少的原因, ACL两个亚基组合对其活性来说必不可少, 当2个亚基的摩尔数相等时, 该酶活性达到最大值[36], 这可能就是2个亚基编码基因表达量并无差异的原因。

4 结论

编码甘蔗ACL 蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1, 其推测的氨基酸序列与其他物种具有高度同源性, 且关键功能域区间的序列高度保守。2个基因均受ABA 、水分胁迫、水分胁迫加ABA 处理诱导表达, 但叶中表达量显著高于根系; 2个基因表达量与ABA 、ROS 含量关系密切, 推测该蛋白参与ABA 调控的植物对逆境胁迫响应的代谢过程。

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