[细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白]什么是细胞凋亡

细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白

一、细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白

1.1细胞凋亡的概念及其途径

细胞凋亡是在生理或病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程，以DNA早期降解为特征，其细胞膜一般保持完整，不伴有细胞内容物的释放，细胞最终分解成凋亡小体后被巨噬细胞或组织吞噬，具体表现为：细胞皱缩，出现凋亡小体；死亡的细胞及凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬，无炎性反应；核浓缩，染色质沿核膜凝集，DNA裂解为180～200bp片段，其电泳图象呈梯状。其中包括以下几种凋亡途径：

1.1.1.死亡受体介导途径

胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子(TNF)受体基因家族成员，其胞外有一段富含半胱氨酸的区域,胞质区有一同源的氨基酸残基组成的结构,有蛋白水解功能,称为“死亡区域”。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递启动凋亡。目前发现至少有五种死亡受体在细胞凋亡信号传导中发挥作用。其中最典型的死亡受体有CD95(称Fas或Apo1)和TNFR1(称p55或CD120a)。CD95是一种广泛表达的糖基化的细胞表面分子,含有335个氨基酸残基。CD95的表达细胞因子如干扰素和TNF刺激，并可由淋巴细胞活化，它通过与其天然配基CD95L结合来诱导细胞凋亡。这个过程的发生是因为Fas是一个同源三聚体分子，可诱导Fas三聚体化，导致Fas分子胞质区的死亡结构域(death domain,DD)与一种具死亡域的Fas相关蛋白FADD(Fas-associat-ed protein with death domain)结合，FADD通过自身的DD与Fas作用，而其死亡结构域DED(death effectordomain)则与caspase-8或caspase-10作用，由于Fas的寡聚化导致了DISC(death-inducing signaling com-plex)的形成及caspase-8、10的寡聚化。Caspase-8、10通过自身剪接作用被激活，从而又可使caspase-3和caspase-7被激活，接下去caspase-3又可激活caspase-6，如此启动caspase的级联反应，最终导致细胞凋亡。而在TNFR1介导的凋亡通路中，三聚化的TN-FR1可汇聚接头蛋白TRADD(TNFR-associated deathdomain)，TRADD通过自身的DD使FADD汇聚并导致caspase-8前体的寡聚化，最终导致caspase级联反应来诱导细胞凋亡。但被激活的的TNFR1还可通过接头蛋白RIP(receptor-interacting protein)形成复合体,经过一系列反应后激活核转录因子诱导LAP表达，而抑制细胞凋亡。这就造成了受体的激活既可以诱导细胞凋亡，又可以抑制细胞凋亡的双向调节作用。

由于Fas与TNFR1是死亡受体途径中的关键通路。研究表明Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bid能在其中发挥重要作用，在正常细胞中,Bid存在于胞液中,但在Fas或TNFR1诱导细胞凋亡时，细胞质溶质中的完整Bid被内源性caspase-8酶切后，将产生一个1.5万的C端肽段和

1.3万的N端肽段。1.5万的tBid肽段在其N端被豆蔻酰基化(N-myristoylation)修饰后，便可移

位到线粒体膜上，引起细胞色素C的释放，进而引发细胞凋亡。

1.1.2.内质网介导途径

内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网对细胞凋亡的作用表现在两个方面：一是内质网对Ca2+的调控，二是凋亡酶在内质网上的激活。Ca2+是真核细胞内重要的信号转导因子，它的动态平衡在细胞正常生理活动中起着举足轻重的作用。因此，作为细胞内重要的钙库，内质网对胞质中Ca2+浓度的精确调控可影响细胞凋亡的发生。大量试验表明，许多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续的升高[1]，这种浓度升高来源于细胞外Ca2+的内流及胞内钙库(如内质网)的钙释放，相对高浓度的Ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响其通透性和膜电位的改变，从而促进凋亡。但是内质网上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白则可以调节网腔中游离Ca2+浓度，使胞质中的Ca2+维持在合适的浓度水平，进而起到抗凋亡的作用[2]。

当Ca2+平衡态受到破坏或在内质网上积累过多的蛋白质时，能够激活凋亡酶引起细胞凋亡。凋亡酶(caspase)是一类天冬氨酸依赖性的半胱氨酸蛋白酶，它在凋亡中起到重要的调控作用，几乎所有的凋亡都有凋亡酶的参与。凋亡酶家族成员按功能可分为两类：一类为激活型凋亡酶(initiator caspase)，如caspase-8、-9，它们可激活下游凋亡酶；一类为效应型凋亡酶(effec-tor caspase)，如caspase-3、-6、-7,它们可直接降解胞内的功能蛋白，引起凋亡。这些凋亡酶均以无活性的前体形式存在，需要激活因子将其激活为活性形式后才发挥作用。研究发现caspase家族中的caspase-12定位于内质网，当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚时内质网可激活caspase-12，活化的caspase-12可进一步剪切caspase-3而参与内质网途径引起的细胞凋亡,但在线粒体信号途径和死亡受体途径中都没发现有caspase-12的激活和参与。这些都表明内质网途径在凋亡中有独特的作用。

1.1.3.线粒体介导途径

失去了赖以生存的生长因子或激素的支持、或者脱离了原来的生长环境、或者由于DNA损伤等因素，可诱导线粒体介导凋亡途径。线粒体在凋亡中的作用包括：释放半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylasparatespecific proteinase，caspase)激活因子如细胞色素C；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与Bcl-2家族蛋白促凋亡和抑制凋亡的功能等相关。有人提出：线粒体在凋亡中起着决定性的作用[3]。

随着细胞凋亡研究的深入，人们发现某些和凋亡有关的基因产物(蛋白质或酶)均可定位于细胞线粒体，并且各种刺激所诱导的细胞凋亡实验中发现线粒体膜的通透性增加，线粒体内的各种蛋白质被释放出来，这些蛋白质包括细胞色素C、Smac/Diabod、AIF(Apoptosisinducing factor)等，从而使线粒体与细胞凋亡之间相关细胞性的研究成为当今生命科学领域的前沿课题。其中AIF及细胞色素C在凋亡中发挥重要的作用。对于细胞色素C，当细胞接到凋亡信号后，线粒体释放出来的细胞色素C进入细胞浆后在ATP或dATP的协同作用下与凋亡蛋白酶活化因子I(Apoptotic protease-acti-vating factor-1,Apaf-1)结合以使其分子结构改变来激活caspase-9前体，并进一步激活其下游caspase-3等酶系列，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。AIF是联系线粒体和核凋亡的另一条通路。

现已证明不同细胞的凋亡过程中都有细胞色素C的释放。关于细胞色素C的释放，它通过线粒体外膜的非特异性破裂和运输细胞色素C孔道的形成进行。细胞凋亡发生时，水和溶质进入基质，引起线粒体的膨胀，内膜的膨胀导致外膜的破裂，从而释放包括细胞色素C在内的各种蛋白。同时线粒体形成足够大的运输通道，现已发现Bcl-2、Bcl-xL、Bax等在平面脂双层中能形成孔道，在脂质体中Bax能发生寡聚化形成具有高传导性的通道并且激活细胞色素C的释放。此外，Bcl-2家族蛋白还可以和其它孔蛋白相互作用，在线粒体膜上形成一个高运输性无选择性的跨越线粒体外膜和内膜的通道PTP(permeability transition pore)，它由位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位子(Adenine nucleotidetranslocatar,ANT)和位于线粒体外膜的电压依赖性离子通道(Voltage-dependent anion channel,VDAC)所组成。PTP的形成，使大量Ca2+涌入到细胞质溶质中，细胞质和线粒体基质间的化学平衡被打破，造成线粒体内膜膨胀，进而引起更多PTP的开放，最终导致内膜的破裂，结果细胞色素C、凋亡诱导因子(apoptosis induc-ing factor,AIF)和胱冬肽酶原释放到胞液中。因为细胞色素C在线粒体途径介导的细胞凋亡中起到重要作用，所以对其释放的调控也很关键。许多研究结果表明，Bcl-2家族蛋白的主要作用位点就在线粒体膜上。其中Bcl-2和Bcl-xL是主要的抗凋亡因子，Bcl-2和Bcl-xL通过BH3结构域与Bcl-2家族的抗凋亡蛋白形成异二聚体，从而维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序，且Bcl-2和Bcl-xL均能抑制细胞色素C的释放，使细胞色素C无法达到激活下游caspase的阀值，保护细胞不发生凋亡。而Bcl-2家族中的Bak、Bax、Bik、Bid是促调亡蛋白，它们可能在其它凋亡因子激活下，易位到线粒体膜上，破坏线粒体的结构和功能。其中Bid能与Bax连接并别构激活Bax，使Bax的N端暴露出来，进而发生同源寡聚化，易位到线粒体膜上，引起细胞色素C的释放，同时还发现被激活的tBid也可与线粒体上的Bak连接别构激活Bak，引起Bak同源寡聚化并插入到线粒体外膜上，引起细胞色素C的释放，诱发细胞凋亡。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白形成孔道的内部性质不同，这造成它们对细胞色素C具有不同调控作用的原因。

凋亡诱导因子AIF是一种存在于线粒体中的万双功能黄素蛋白，具有促进凋亡的作用。在细胞凋亡过程中，AIF从线粒体中释放出来，直接进入细胞核并独立作用于染色质，进而在有关胱冬肽酶依赖性去核糖核酸酶的催化下，引起DNA的大规模断化和染色质浓缩，使细胞发生凋亡,并且胱冬肽酶抑制剂不能抑制AIF的促凋作用。此外，AIF还可通过自身放大回路来影响线粒体膜的通透性，使其释放更多的AIF，最终破坏细胞内线粒体的正常功能。研究表明，AIF介导了独立于caspase影响之外的另一条凋亡途径，其凋亡活性是由胚胎早期发育所必需的。在所有原生动物都发现有AIF的同源物，而植物、真菌或某些单细胞生物中在没有证据表明caspase存在的情况下都可进行程序性细胞凋亡。所以可以认为AIF以及AIF调节的凋亡，构成了多细胞生物形态发生所必需的一种原始而保守的程序性凋亡途径。但目前对胞浆中直接作用于AIF的上游蛋白及核内AIF的底物还不确定，特别是AIF介导凋亡的准确机制及AIF与其它参与染色体凝集和降解因子的关系、信息交流的方式等需要深入研究。

此外，Smac/Diabo(the second mitochondrial-de-ived activator of caspase)在细胞凋亡时也被释放出来，它与细胞色素C一起释放到胞浆，通过与LAPs(in-ibitor-of-apoptosis proteins)、XIAP结合发挥促凋亡作用从而成为线粒体途径的一部分。它本身不能诱发细胞凋亡,只是解除凋亡抑

制。研究发现Smac/Diabo比细胞色素C大，它在线粒体中的释放是否与细胞色素C同步还有待证明，并且只有成熟的Smac/Diabo才有生物活性,因此在其释放前必须有个加工过程。

总之，越来越多的证据表明作为能量供应站的线粒体在细胞调亡过程中发挥着关键性的作用。它不仅可以通过自身释放细胞色素C等物质介导凋亡，还可以与其它凋亡诱导因子共同作用而改变自身的活动状态以更好地调控细胞凋亡。线粒体作为细胞凋亡的中心环节，构成了凋亡的一个信号转导途径。

1.2 Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径发生作用的机制

近几年，关于Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径对细胞凋亡影响的研究，有了很大的进展。研究证明，线粒体外膜通透性的改变可引起细胞凋亡，而这种通透性的改变直接由Bcl-2家族蛋白控制[4]。具体作用机制，主要被认为有以下两种：一是Bcl-2家族蛋白成员精确地改变线粒体膜的通透性；二是Bcl-2家族蛋白能够诱导线粒体通透性转变孔道的开放。

Bcl-2家族蛋白能够独立改变线粒体膜的通透性。Bcl-2家族蛋白与白喉毒素孔形成区域相似，这些蛋白能插入生物膜中，形成离子转导通道[5]。Kuwana等[6]用原子显微镜观察到，由二维脂质双层中的Bax所形成的大孔道。Saito等[7]发现，重组Bax可以独自从完整的脂质体中释放出用荧光标记的细胞色素C；并且计算的结果显示，这个通道是由4个Bax分子组成，它的直径正好使细胞色素C分子通过。一些研究者认为，孔道的形成是由于在细胞凋亡时，Bax和Bak寡聚到线粒体的外膜上。Bid经caspase-28修剪或重组后，到达线粒体外膜，并寡聚到Bax和Bak上，这种寡聚可能对膜通透性的改变具有重要的作用。

Bcl-2家族蛋白诱导线粒体通透性转变孔道的开放。一是通透性转变孔道开放，线粒体的外膜不受损伤，膜间隙中的细胞色素C、Smac/DIABLO、凋亡诱导因子和核酸内切酶G等被释放到细胞质中；二是通透性转变孔道的开放后，使线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡流动，造成线粒体基质的高渗状态，线粒：体发生膨胀，外膜破裂，从而使膜间隙中的促凋亡蛋白被释放到细胞质中。这些促凋亡蛋白或激活caspase或独立地破坏核内染色质，引起细胞凋亡。通透性转变通道是由线粒体一些内膜外膜蛋白组成的，定位于内外膜接触点，并可以无选择性地允许Mr≤1.5×103的分子通过。通透性转变通道是线粒体的刺激感受器，被认为是细胞生死的开关[8]。细胞色素C是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并与内膜松弛相连。在线粒体损伤后，细胞色素C从构建的孔隙中进入细胞液，与抗恶性贫血因子1和caspase-9组成了凋亡复合体。在caspase-9被激活后，再作用于其下游的caspase-3酶原，活化的caspase-3作为效应子，作用于不同的靶分子，经蛋白水解作用导致细胞凋亡。研究发现，Bcl-2家族蛋白对细胞色素C的释放具有最明显的调控效应[9]。Susin等[10]证实了线粒体释放的另一种凋亡诱导因子及其作用机制。凋亡诱导因子定位于线粒体膜间隙腔中，当凋亡发生时，其首先从线粒体间隙转移到胞质中，继而再转移到细胞核中。凋亡诱导因子可以引起纯化的胞核内染色质的异常凝集，核DNA的大规模片段化[11]。核酸内切酶G是线粒体释放的另一种凋亡因子，其功能与凋亡诱导因子相似：其从线粒体膜间隙中被释放后，导致细胞核内DNA的片段化反应[12]。Smac是近年来被发现的线粒体促凋亡蛋白，当细胞发生凋亡时，Smac被释放到细胞质中促进细胞凋亡。最近有报道称，Smac具有特异性氨基酸末端序列，能够激活caspase-3前体，导致细胞凋亡[13]。

1.3 Bad蛋白对细胞凋亡的调控作用

近年来，在细胞凋亡调控中起重要作用的B细胞淋巴瘤-白血病-2(B-cell leukemia-2，Bcl-2)家族蛋白的研究众多，Bcl-2被证实是最重要的有明显抑制细胞凋亡作用的基因。随着研究的深入，人们发现众多与Bcl-2有较高同源性的基因，它们构成庞大的Bcl-2家族，已发现并命名的Bcl-2家族成员有近20种之多。它们有的抑制凋亡，有的为凋亡的促进者。抗凋亡成员(又称抗凋亡蛋白，antiapoptotic proteins)有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al、ced-9等，促凋亡成员(又称凋亡前体蛋白，Proapoptotic proteins)有Bad、Bax、Bak、Bid、Bik、Bim、Bcl-xs等。促凋亡成员又分为两类；仅含BH3同源区域(BH3 only Proteins)的成员，包括Bik，Bid，Bad，Bim，Bmf等；含多个同源区域(Bcl-2 homology domain，BH)的成员，包括Bax、Bak、Bcl-xs、Mtd。其中Bad是主要的促凋亡基因之一，近年研究发现，Bad可通过细胞信号转导通路及与天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成员作用而促进细胞凋亡。

1.3.1.Bad蛋白

Bad基因首先从鼠的cDNA文库中克隆鉴定出[14-15]，其后又克隆出人的同源基因，由Yang等[16]于1995年发现，其编码一个含204个氨基酸，分子质量22.1×103的蛋白质。双杂交和序列分析发现，Bad可与Bcl-2和Bcl-xL结合形成异源二聚体，具有促进细胞凋亡作用，故名Bad(Bcl-xL/Bcl-2 associateddeath promoter)，它存在Bcl-2家族成员BH3同源结构域和序列。与Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL相似，此结构域是Bad与Bcl-2家族蛋白结合所必需的。Bad的促凋亡作用依赖于与Bcl-2或Bcl-xL结合，胞外的Bad还能通过与一种细菌毒素的转运结构域结合进入细胞，诱导凋亡。Hong等[17]发现，Bad在某些病毒感染时还可与病毒受体结合，可能通过酪氨酸激酶途径激活细胞凋亡。

Bad蛋白的结构特点和生物学特征：

Bad蛋白是含有BH3结构域的凋亡前体蛋白，Bcl-2成员均由1~4个BH构成，BH1~BH4均具有α螺旋结构。目前发现的所有抗凋亡蛋白均具有BH1~BH4四个同源区域，而促凋亡蛋白除Bcl-xs外均缺乏第一个螺旋片段BH4区域[18]。BH3区域对于促凋亡蛋白来说似乎是最重要的功能区，因为已发现的促凋亡因子Bid、Bad和Bim等都只有BH3区，而且经证实所有仅含BH3区蛋白的成员都是促凋亡的，且都与某个凋亡抑制家族成员相互作用。目前认为仅含BH3区蛋白是程序性细胞死亡的必须启动子，它们参与识别不同类型的刺激，通过灭活Bcl-2家族中促生存成员的保护功能，并激活促凋亡的家族成员来发动凋亡。BH3结构域也是Bad与Bcl-2家族蛋白结合所必需的，其促凋亡作用依赖于与Bcl-2或Bcl-xL的结合。

生理状态下Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员绝大部分都位于特定的亚细胞结构中[19]。抗凋亡成员为膜的内在蛋白，分别与内质网膜、线粒体膜和核膜相结合。Bad等促凋亡成员在没有凋亡信号时大部分位于胞质中，少量疏松黏附于细胞内膜结构。在凋亡刺激信号作用下，促凋亡成员发生构型改变，易位并插入线粒体外膜发挥促凋亡活性。线粒体通路正是Bcl-2家族基因调控凋亡的主要途径。

Bad蛋白的表达：

Bad在外周及中枢神经元、淋巴细胞、骨髓造血细胞、生殖细胞及许多上皮细胞中均有表达。近年来其在缺血损伤方面的研究受到重视，肿瘤方面的研究多见。脑缺血后Bcl-2基因家

族在脑内表达有明显的改变，此方面的研究是新的热点。

Dluzniewska等[20]建立鼠暂时性脑缺血模型，用免疫细胞化学方法在电镜下发现海马CA1区神经元Bad蛋白表达增加，并通过Western Blotting的方法和免疫双标法证实CA1区Bad蛋白由胞质易位至线粒体的过程。Tan等[21]认为Bad蛋白能通过其磷酸化和去磷酸化调控其在线粒体膜上与Bcl-2和Bcl-xL的异二聚体的作用。Uchino等[22]在暂时性全脑缺血大鼠海马区神经元细胞观察到与凋亡相关的由钙调磷酸酶诱导的Bad蛋白的去磷酸化和Bad蛋白表达增加。研究表明[23]，Bad/Bcl-xL通过Bad通路调控缺血再灌注脑神经元凋亡。Dennis等[24]建立暂时性视网膜缺血模型，观测到视网膜神经节细胞层和内核层细胞中的Bad蛋白表达上调，此外，这些细胞中大多都可见DNA断裂的损伤表现，而DNA断裂是凋亡细胞的一个典型特征。

Bcl-2在多种肿瘤组织中均有较高表达，可抑制多种因素诱发的细胞凋亡，促凋亡成员Bad在肿瘤中的表达具有重要意义。Ichinose等[25]发现，Bad蛋白磷酸化后失活，失活的Bad加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化；Kohler等[26]发现，Bax和Bad的高表达与急性白血病的预后不良相关，可作为一个预后指标，在Bcl-2和Bcl-xL过表达的情况下，Bad可直接诱导凋亡，具有治疗意义。

1.3.2.Bad蛋白参与凋亡的可能机制

Bcl-2家族蛋白通过转录水平的调控及转录后调控来发挥作用，但转录调控不是其发挥作用的主流形式，各种转录后调控，如磷酸化-去磷酸化修饰，二聚体的形成，蛋白质剪切、解及Bcl-2成员在亚细胞水平的易位更为重要，这些过程能有效精确地调节内外源性凋亡信号通路。Bad蛋白的转录后调控专主要是磷酸化修饰和二聚体形成，另外其促凋亡作用与BH3区域密不可分。

Bad蛋白对凋亡的调控与其磷酸化-去磷酸化修饰有关：

生理状态下，磷酸化的Bad与14-3-3蛋白结合成复合物稳定存在于胞质中发挥抗凋亡效应；接受凋亡信号刺激后，调磷酸酶等诱导Bad去磷酸化，去磷酸化的游离Bad通过易位和一系列细胞活动促进凋亡的发生。

据报道[27，28]Bad蛋白有三个磷酸化部位，分别在Ser112、Ser136和Ser155:线粒体相关蛋白激酶(mitochondria-associatedprotein kinase，PKA)、Ras-丝裂原激活的蛋白激酶(Ras-mitogen-activated protein kinese，RSK)及p21激活的蛋白激酶(p21 acti-vated kinase1，PAK1)诱导Ser112磷酸化；PAK1或ATP依赖的酪氨酸激酶Akt诱导Ser136磷酸化；RSK或PKA诱导Ser155磷酸化。Ser170也是一个磷酸化部位，诱导此部位磷酸化的激酶还未确定，但此处磷酸化也产生对抗凋亡的效应。Datta等[28]报道在体外，至少有四种激酶(PKA、Akt/PKB、PKC、Raf1)能使Bad磷酸化。但这些激酶中只有PKA、Akt/PKB能使Bad中与14-3-3蛋白结合相关的Ser112或Ser136磷酸化。Akt是一个丝/苏氨酸激酶，位于磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的下游，为许多促细胞生存信号蛋白所激活，包括胰岛素样生长因子1、白细胞介素3和神经生长因子。另外Akt也可被Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活。激活的Akt使Bad中的Ser136磷酸化，导致14-3-3蛋白与Bad的结合并抑制Bad所诱导的细胞凋亡。Bad中的Ser112也可被线粒体上的PKA磷酸化而抑制Bad的促凋亡作用。但此过程是否需要14-3-3蛋白的参与还须进一步考证。

Henshall[29]和Meller等[30]研究癫痫发作致神经元凋亡的调控机制并描述了Bad信号通路的激活过程：当Bad以磷酸化形式与14-3-3蛋白结合时无活性，稳定的存在于胞质。磷酸化的Akt对于保持这一构型的稳定性很重要，Akt的磷酸化又由PI3-K维系。癫痫发生以后，PI3-K失活，Akt去磷酸化，Bad的磷酸键与14-3-3蛋白断开而分离，变为去磷酸化的Bad，游离的Bad构型改变，它从Bax-Bcl-xL二聚体中夺取Bcl-xL而释放出Bax，游离Bax形成二聚体并向线粒体膜易位并插入其中，其疏水核心形成一个孔道结构，使细胞色素C(Cyto C)释放至胞质，引起caspase酶系级联反应导致凋亡。他们还证实了癫痫发作后Bad与14-3-3的解离及Bad与Bcl-xL的结合。

Bad蛋白对凋亡的调控与二聚体的形成有关：

Bcl-2成员之间易于形成同源或异源二聚体，这种二聚体反应调节细胞死亡和存活信号的平衡状态，是决定细胞存亡的关键。Bad蛋白的促凋亡作用就依靠其与Bcl-xL和Bcl-2在线粒体外膜处的结合来完成。Bcl-xL与Bax形成异二聚体而阻断后者的促凋亡活性，去磷酸化的Bad与Bax竞争，从Bcl-xL/Bax二聚体上夺取Bcl-xL，释放游离的Bax启动凋亡通路。Bcl-2成员形成二聚体有选择性，且不同伴侣分子结合的强度也不同。因此，在一个特定的哺乳动物细胞，每个成员是否存在及其浓度决定了占优势的二聚体的类别，最终决定了细胞的命运。Bad可以说是Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bax异二聚体的负调控基因，依靠自身的强结合力，以浓度依赖性方式替换Bcl-2/Bax，Bcl-xL/Bax二聚体中的Bax，使Bax游离后成为二聚体而促进凋亡，当一细胞系所有细胞中的Bax同源二聚体含量>80%，再加上适当的信号诱导，细胞就出现凋亡，这表明Bad通过调节Bax同二聚体与异二聚体的比值介导凋亡，类似的，当一细胞系所有细胞中的Bcl-2/Bax，Bcl-xL/Bax异二聚体的含量≥50%时，则细胞耐凋亡。

Bad蛋白的促凋亡作用与其BH3区域密不可分：

BH3区是Bad蛋白重要的功能区，Bad与Bcl-2家族蛋白结合必需此结构域，在细胞凋亡刺激物存在时会出现BH3表达增多或翻译后修饰的现象，此时BH3蛋白结合Bcl-2和Bcl-xL，使其对抗Bax和Bak的作用减弱，促使凋亡发生。

研究发现[31]与Bad结构相似的促凋亡因子Bak与Bcl-xL形成二聚体。此时Bcl-xL的BH1，BH2和BH3区相互靠近，形成一个“疏水口袋”，将Bak的BH3区保护于其中，屏蔽了BH3区的促凋亡活性。凋亡时，二聚体结构解离，“疏水口袋”样保护性结构丢失，Bak暴露出BH3区域，暴露出的BH3区则易于攻击线粒体外膜。因此，可以推测Bad蛋白的BH3区也通过类似机制诱导凋亡发生。

1.3.3.从细胞接受刺激信号到产生凋亡的过程中，Bad处于什么位置，细胞中Bad参与的促凋亡反应具体是怎样的？

在凋亡诱导因素的刺激下，细胞的跨膜或者胞内信号通路被启动。其中Bad与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路联系的研究较多。MAPK通路是细胞外多种刺激传向细胞内信号的转导的交汇点，其级联反应中包括3个关键的激酶，细胞外信号调节激酶(Erk1/2)活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键。

研究发现[27]，Erk1/2通过磷酸化抗凋亡分子(如BadSer112)，同时激活转录因子(如CREB Ser133)以刺激表达存活相关基因而产生抗凋亡作用。此时对线粒体来说，Bad蛋白的磷酸化和

非磷酸化将成为一个检查点。非磷酸化Bad从线粒体膜表面的Bcl-xL/Bax异二聚体上夺取Bcl-xL，释放Bax，Bax发生蛋白质剪切，构型改变而二聚化，Bax二聚体向线粒体膜易位并插入其中，其疏水核心形成一个孔道结构，使Cyto C释放至胞质内从而形成线粒体Ca2+内流和Cyto C外流的交换通道，启动凋亡通路。这将导致膜电势降低、ATP形成不足及下游caspases活化；而磷酸化Bad则可能诱导Bax的单聚化而失去作为凋亡诱导信号的功能。相反，地塞米松刺激下，Erk1/2通路被显著抑制。结果是Bcl-2等抗凋亡活性蛋白失去Erk1/2的磷酸化激活，加速了凋亡的发生。且由于Bad蛋白不能被磷酸化，导致下游的线粒体膜电势的崩溃和ATP形成不足，内质网等Ca2+库不能维持正常功能，游离Ca2+流入胞浆诱发凋亡。Valks等[32]也阐述了心肌细胞中通过Erk1/2信号通路介导的Bad(Ser112，Ser155)的磷酸化及类似的后续过程。

综上所述，Bad是与Bcl-xL和Bcl-2相关的细胞死亡促进因子，是调控细胞凋亡的重要成员，主要通过线粒体途径参与细胞凋亡。在缺血性损伤，肿瘤发生和发展等多方面发挥调控细胞凋亡的作用，其促凋亡作用与其自身结构特点和与其他Bcl-2家族成员的相互作用有关。应用其调控凋亡的作用，在缺血损伤中若从避免其去磷酸化入手阻断Bad通路激活可达到抗凋亡目的或在肿瘤的治疗中，促进其磷酸化来抑制细胞恶性化。随着对凋亡及其调节因子的不断认识，提醒人们通过抑制或促进基因表达来达到基因治疗的目的，为临床工作提供更好的医治思路。

1.4 Erk在细胞凋亡中对Bcl-2家族的调节

有较多的研究资料显示，作为重要的细胞周期相关蛋白激酶途径，Ras-Raf-MEK-Erk信号通路的激活促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。这主要是因为Erk1/2激酶与Bcl-2家族蛋白有着密切的关系。调节蛋白Bcl-2的抗凋亡效应依赖于其BH3和BH4结构域间的丝氨酸残基磷酸化，而Raf-MEK-Erk信号途径参与并抑制Bcl-2的磷酸化，这为Erk激活和细胞存活之间提供了潜在的联系[33]。Erk1/2的激活不但可以上调Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达，而且可以诱导其活化[34-37]。另外，活化的Erk1/2可以使Bad的ser112位点磷酸化，磷酸化的Bad与Bcl-2或Bcl-xL发生解聚，并且与磷酸丝氨酸结合蛋白14-3-3结合，游离的Bcl-2或Bcl-xL则促进细胞的抗凋亡作用。因此，游离的Bcl-2和磷酸化的Bad是促进细胞生存的关键物质[38]。虽然多数研究表明Erk途径主要参与细胞增殖活动，但也有实验发现，Erk途径也可促进细胞凋亡。在人B细胞的研究中，Erk参与诱导细胞凋亡[33]；Boucher等[39]以胰腺癌细胞作为研究模型，分析Erk1/2在细胞生存中的调节作用以及相关机制，发现Erk1/2的抑制剂以引起细胞G1期的阻滞及抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL表达下调，加了caspases-3，6，8，9的活性，但对促凋亡蛋白Bax和Bak的表达无影响。

1.5 PI3K-Akt信号通路抗细胞凋亡的机理

近年来研究表明，PI3K-Akt能经多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞存活。PI3K-Akt信号通路抗细胞凋亡的机制主要有：

1.5.1.直接调节作用

哺乳动物细胞的细胞凋亡是多级联反应的过程。Bad是Bcl-2家族成员之一，可与Bcl-2或Bcl-xl形成复合体而表现促凋亡活性。Bad的功能受它的Serl12和Ser136位点磷酸化所调

节。Bad一旦磷酸化，磷酸化的Bad能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白结合，从而阻断Bad与Bcl-2/或Bcl-xl形成二聚体，使Bad不能发挥促细胞凋亡作用。Akt是强有力的Bad激酶，活化的Akt可以使Bad的Ser136位点磷酸化，有效阻断Bad诱导的细胞凋亡。当用特异的PI3K抑制剂wortmannin和LY294002处理后，Akt引起的Bad磷酸化受阻[40]。Akt也能磷酸化Bcl-2家族成员BAX的Ser184位点，负调控促凋亡功能[41]。促凋亡相关因子如半胱天冬酶caspase-9是细胞凋亡的启动者和效应者。活化的Akt可以使caspase-9 Ser196位点磷酸化而失活，抑制其促凋亡作用[40]。Par-4是一种促凋亡蛋白，Goswami等[42]研究表明，Akt能结合并磷酸化Par-4，从而灭活Par-4的促凋亡作用。通过PI3K抑制剂PTEN、LY294002或DN-Akt1等直接或间接抑制Akt的活性，能够解除Akt对Par-4促凋亡作用的抑制，增加肿瘤细胞的凋亡，而且研究还表明，这种凋亡是Par-4依赖性的。

1.5.2.通过直接或间接影响转录因子家族(Forkhead、NF-κB、p53等)发挥细胞存活调控作用 叉头转录因子(Forkhead or FoxO)家族成员的4个亚型(FKHR/FoxO1、FoxO2、FKHRL1/FoxO3和AFX/FoxO4)均能被Akt直接磷酸化，磷酸化后的Forkhead蛋白能抑制促凋亡基因的转录功能，负调节凋亡促进信号，促进细胞存活。Forkhead蛋白的靶基因是包括胞外的配体FasL、TRAIL、TRADD和胞内的凋亡组分Bim、Bcl-6[43]。磷酸化的Forkhead家族转录因子能降低FasL的表达，从而减少细胞凋亡。在肿瘤细胞中，NF-κB的典型功能是抗凋亡，从而赋予肿瘤细胞存活的优势。NF-κB的活性依赖于IκB激酶(IKK)复合体的磷酸化和IκB的失调。Vandermoere等[44]研究证明Akt能够直接或间接调节IKK的活性，导致NF-κB的核转位、活化和NF-κB依赖的促进存活基因的转录。Akt使NF-κB磷酸化后，激活它的转录功能，使促进细胞存活的Bc1-2家族成员Bcl-xl表达增强，从而促进细胞存活，当用特异的PI3K抑制剂wortmannin和LY294002处理后，NF-κB的活化受到抑制。另外，Akt同时还能使NF-κB的抑制酶IκBa磷酸化，使NF-κB进入核内，调节抗凋亡基因的转录[45]。P53是一个重要的介导DNA损伤引起的细胞凋亡的蛋白，其水平和功能能够被MDM2泛素连接酶抑制。MDM2是P53的一种负性调节蛋白，能够结合P53蛋白，使P53的转录调节功能失活。Akt能结合MDM2并磷酸化其Ser166和Ser186位点，诱导核输入或上调泛素连接酶的活性，进而促进P53的失活或降解，阻断P53介导的促凋亡转录反应[46，47]。YAP是转录辅激活因子，它能够与核磷蛋白P73相互作用，并增强由于DNA损伤介导的P73依赖型凋亡，用特异的SiRNA沉默YAP基因，能够延缓或减少P73介导的凋亡[48]。YAP是近年来才被证明的Akt的底物，Akt能够磷酸化YAP的Ser127位点，磷酸化的YAP是P73转录活性介导的凋亡抑制因子[49]。

1.5.3.通过调节细胞周期影响细胞增殖

哺乳类动物雷帕霉素(the mammaliantarget of rapamycin，mTOR)是Akt下游的一个重要作用靶点，能够被Akt磷酸化激活，通过调控核糖体激酶p70s6k(ribosomal S6-kinase，RSK)和4E-BP-1两条不同的下游通路，分别控制特定亚组分mRNA的翻译，进而调节蛋白质的合成，影响细胞的增殖。研究表明，mTOR的活性能够被PI3K的抑制剂wortmannin和LY294002所抑制，抑制mTOR能够阻断其下游的p70s6k与4E-BP-1的信号通路，阻滞细胞周期在G1期，导致细胞生长停滞[50]。

1.6 Caspase在细胞凋亡中的作用

Caspase家族广泛存在于细胞中，主要以酶原的形式存在，各成员分布和表达有一定的组织特异性。Caspase家族是半胱氨酸依赖性细胞死亡蛋白酶，是一大类凋亡调节基因。可分解细胞骨架中的结构蛋白、调节细胞周期和DNA修复所需的功能蛋白，与线虫Caenorbditis elegans的死亡基因ced-3同源，是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者。

所有Caspase都由一个前域(prodomian)和一个酶的区域组成，由于前域的结构、蛋白酶之间存在着多相性，根据酶原N端被切割肽段的长度，Caspase可分为长前域和短前域。长前域主要起激发和调节凋亡的活化作用，其中以Caspase-2、Caspase-8、Caspase-10为代表，它们都有两个约60个氨基酸的蛋白-蛋白作用基元(motif)，称为“死亡域”(death effector domain，DED)，调节与其它蛋白的结合及传递信号。短前域主要进行蛋白质酶解作用，主要有Caspase-

3、Caspase-6、Caspase-7等代表，又称效应Caspase，其作用为在链的下游末端去剪切底物。

对Caspase诱导凋亡机制的认识很大程度上取决于对其作用底物的发掘，近年来已有40多种Caspase底物得到发现。根据蛋白酶对其底物酶切后产生作用的后果不同，将其底物分为四大类：第一类是被酶切后活化的底物，如Caspase本身切割可引起自身活化，PKC-δ、P21激活的激酶2(PAK2)、凝脂酶A2、类固醇调节元件结合蛋白(SREB)等；第二类为酶切后失活的底物，如DNA催化亚单位、视网膜母细胞瘤抑制蛋白等；第三类为酶切后改变其结构的蛋白，如A型和B型细胞核Lamin及Gas2；第四类为酶切后对凋亡作用尚不清楚的底物，如PARP[poly(Aop-ribose)polymerase]DNA-PAKs等。通过对底物的作用引起的变化包括：阻遏细胞周期循环；破坏细胞平衡状态及修复机制；使细胞从周围的组织结构中脱落；使维持细胞结构的物质解体；磷脂酰丝氨酸(PS)为其他细胞如巨噬细胞作包裹吞噬的标记。

在细胞凋亡过程中有多种Caspases共同参与，不同类型的细胞可能含有不同的Caspases群体，不同的凋亡刺激信号也可能活化不同的Caspases，因而各种细胞的凋亡途径亦不尽相同。Caspase在正常情况下以无活性的前体形式合成与贮存，而凋亡信号可激活Caspase级联反应，其中Caspase-3，8，9是主要的Caspase分子，Caspase-3被称为“执行者”(executioner caspases)，Caspase-8，9被称为“发起者”(initiator caspases)。在Fas或TNF诱导的凋亡中“发起者”是Caspase-8，而在许多刺激诱导的凋亡中，“发起者”是Caspase-9。Caspase-3能直接水解底物，包括细胞质和细胞核内与DNA修复、复制，RNA剪切和细胞骨架等相关的蛋白质，并导致细胞凋亡。

Caspase-9处于Caspase“瀑布式”激活的顶端，Caspase-9酶原经蛋白酶水解成大小亚单位，在细胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和dATP的参与下形成有活性的二聚体，直接或间接激活下游的效应分子Caspase-3，6，7，而激活的Caspase-3，6，7去分解lamins，PARP(poly ADP-ribose polymeras)等，再激活核酸内切酶，导致DNA片断化。激活的Caspase-9切割Caspase-3酶原，使Caspase-3激活，引发caspase级联反应，裂解核蛋白、细胞骨架、内质网等，造成凋亡典型的形态学改变，如细胞核染色体固缩和裂解，染色质密度增高，核和胞体分离，形成多个凋亡小体[51-57]。

细胞凋亡信号转导途径图

The transduction pathway of cells apotosis

杨梅素诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制图

The mechanism of myricetin inducing the human hepatoma HepG-2 cells apotosis

二、杨梅素化学及药理作用的研究进展

2.1 杨梅素物理化学研究

杨梅素(myricetin. Myr)化学名称为3，5，7，3"，4"，5"-

六羟基黄酮，又名杨梅树皮素、杨

梅黄酮、杨梅酮，属于黄酮类化合物。化学式C15H10O8，相对分子量318.24，黄色针状或颗粒状结晶，盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，与FeCl3乙醇液反应呈墨绿色，与AlCl3反应呈强黄绿色荧光，α-萘酚-浓H2SO4反应呈阴性，与NaOH反应呈黑绿色。熔点324-326℃，UV(MeOH)：375.0nm，255.0nm。溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿、石油醚。存在于壳斗科（Fagaceae）、豆科（leguminosae）、报春花科（Primulaceae）、葡萄科（vitaceae）、菊科（compositae）等植物中[58]。

杨梅素化学结构式

Structure of myricetin

2.2 杨梅素药理活性研究进展

2.2.1.抗肿瘤作用

Ching-Huai Ko等[59]人研究表明杨梅素对结肠直肠癌中基质金属蛋白酶2(MMP)的表达和活性有抑制作用，通过影响蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，细胞外信号调节激酶（Erk）的磷酸化和c-Jun的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。Zhang Q[60]发现杨梅素具有细胞毒作用，虽然毒力较弱，但同其他黄酮类成分一样，通过使细胞停滞在G2/M导致细胞凋亡。Wang IK[61]发现杨梅素可以通过促进细胞色素C释放和激活caspase-9和caspase-3诱导白血病HL-60凋亡。同时也发现其凋亡作用与羟基基团种类和数量有关。Ko CH[62]研究发现，杨梅素影响蛋白激酶

C、细胞色素C和caspase级联反应，通过线粒体依赖和活性氧独立途径导致肿瘤细胞凋亡。研究发现C3"，C4"和C5"位羟基是杨梅素诱导凋亡的主要功能团，杨梅素可以改变线粒体膜电位，同时降低Bcl-2/Bax蛋白含量，而蛋白激酶C的相关抑制因子GF-109203X、H7等可以阻止这些作用。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。Lu J等[63]提出杨梅素通过抑制硫氧蛋白还原酶活性，使肿瘤细胞停滞于G1晚期，进而引起细胞死亡。据报道，杨梅素不引起小鼠体内肿瘤形成，而且能降低每只小鼠二元环氧化物诱导的肺肿瘤数量，抑制小鼠上皮和肺细胞稠环芳烃代谢及后继的多环碳氢化合物–DNA内转形成。杨梅素对2期皮肤癌的发生起保护作用，而且通过抑制硫氧还蛋白还原酶活性抑制肺癌细胞A549生长。Ki Won Lee等[64]发现杨梅素是赘生性细胞转化和MEK1的天然抑制剂，其影响MEK信号通路具有抗肿瘤的潜力。杨梅素和白藜芦醇复合物对12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)和上皮生长因子(EGF)诱导的细胞转化没有协同作用。杨梅素减弱肿瘤启动因子(EGF)-诱导的c-fos和活化蛋白-1（AP-1）的激活作用。而白藜芦醇没有这个作用。杨梅素抑制MEK1活性很强，同时抑制TPA和EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Erk）和其下游区靶点p90核醣体S6激酶的磷酸化。此外，对比MEK抑制剂PD098059和白藜芦醇，杨梅素可以有效的抑制H-Ras诱导的细胞转化。杨梅素直接与谷胱甘肽S-转移酶MEK1结合，不与其竞

争ATP位点。总之，杨梅素有抗癌活性，靶向作用于MEK信号。另据报道，杨梅素对EGF诱导的细胞转化有抑制作用，EGF可以激活PI3K/ATK和Erk信号通路[65]。对胰腺癌细胞信号传导途径PI3K/ATK有阻滞作用[66]。环氧化酶-2（COX-2）的异常表达和肿瘤发生有关，杨梅素（10-20microM）通过阻断小鼠表皮细胞中核因子kappaB活性抑制佛波醇酯诱导的COX-2和前列腺素E的表达。通过荧光分析，杨梅素抑制佛波醇酯诱导的JB6P+细胞中COX-2和NF-kappaB转活。电泳迁移率变动分析表明杨梅素阻断了NF-kappaB的DNA的活性[67]。以上资料证明杨梅素是一种有效的致癌作用化学防治剂。

2.2.2.降低神经毒性

神经功能紊乱可以导致多种疾病，如局部缺血和老年前期痴呆。杨梅素可以有效阻止神经损伤。Shimmyo Y等人[68]研究表明杨梅素通过多种不同途径抑制由谷氨酸引起的神经毒性来保护神经元。这种由谷氨酸引起的神经毒性是通过N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、活性氧簇(ROS)增殖和caspase-3激活引起的胞内Ca2+过载导致的。首先，杨梅素调节NMDAR磷酸化，降低谷氨酸引起的胞内Ca2+过载。其次，杨梅素抑制谷氨酸引起的ROS的产生。最后，杨梅素阻止caspase-3激活。此外，杨梅素通过3氢键直接与caspase-3活性位点结合抑制其活性。总之，杨梅素可以通过不同的生化途径阻止由谷氨酸引起的神经毒性。同时，Ma ZG等[69]也证明了杨梅素降低6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的小鼠的多巴胺神经损伤。高效液相电化学检测经6-OHDA处理后纹状体中多巴胺含量减少，杨梅素可以改变这种情况。免疫组织化学和半定量RTPCR研究表明杨梅素可以阻止6-OHDA诱导的黑质-纹状体中酪氨酸羟化酶阳性神经元和酪氨酸羟化酶的mRNA表达降低。Perls"铁染色法进一步证明杨梅素处理组的铁染色细胞数较6-OHDA处理组显著减少。杨梅素鳌合铁的特性是杨梅素对DA能神经元的保护机制。由于杨梅素对大鼠下丘脑R-氨基丁酸系统的调制作用及对6-羟基多巴胺损伤大鼠黑质-纹状体系统的保护作用，所以杨梅素对睡眠调节有帮助。

2.2.3.对淋巴细胞活化及增殖的影响

俞瑜等人[70]研究了杨梅素对小鼠T细胞活化及增殖的影响，无菌分离小鼠淋巴结细胞，加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h，用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化，利用荧光标记的单克隆抗体双染技术，流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+T细胞CD69表达的影响；采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响，采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2mRNA表达的影响。采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响。结果表明杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达，并能抑制淋巴细胞增殖反应，同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用。杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用。

2.2.4.血小板活化因子(PAF)的拮抗作用

陈文梅等[71]以比浊法测定家兔洗涤血小板(WRP)聚集，邻苯二甲醛(OPT)荧光法测定52HT浓度，Fura22荧光探针测定血小板内游离钙离子浓度。观察杨梅素对血小板激活因子(PAF)诱导的兔洗涤血小板聚集、52HT释放及血小板内游离钙离子浓度升高的影响。结果表明杨梅素体外呈浓度依赖性地抑制PAF诱发的WRP聚集及52HT释放。杨梅素抑制WRP聚集的IC50为1715μmol/L；抑制52HT释放的IC50为6411μmol/L。同时杨梅素能明显抑制PAF引起的

血小板内游离钙增高。臧宝霞等在此基础上进一步研究了杨梅素对PAF的拮抗作用以及杨梅素抑制PAF与兔血小板受体特异性结合的作用，试图从细胞及分子水平阐明杨梅素抗PAF作用的机理。以放射配体结合试验观察[3H]PAF与家兔血小板受体特异性结合的作用；以分光光度法测定PAF诱发血小板黏附的强度；以Fura22荧光分光光度法测定兔多形核白细胞(PMNs)内钙离子浓度。结果表明了杨梅素具有抗PAF作用，为一新的PAF受体拮抗剂。因此杨梅素具抗血栓、抗心肌缺血、改善微循环等多方面的心血管药理作用，有望将其开发为活血化瘀类药物[72]。

2.2.5.降血糖作用

YoshikawaM等[73]，在研究抗糖尿病机理药物的机理时发现，杨梅素对高血糖小鼠有降血糖的作用。钟止贤[74]等采用四氧嘧啶所致糖尿病模型、肾上腺素和葡萄糖引起的高血糖小鼠模型，以及正常小鼠，在口服给药后，测定各模型小鼠的血糖水平。结果杨梅素对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠和肾上腺素、葡萄糖引起的高血糖小鼠均有明显的降血糖作用，治疗效果良好，但对正常小鼠血糖无明显影响。Liu IM等[75]研究连续6周用含有60%果糖的食物喂养小鼠后，给予杨梅素观察其胰岛素耐受性。连续静注杨梅素14天（每次1 mg/kg，一天3次），发现小鼠血浆中高糖和三酸甘油酯含量明显降低。而且小鼠的胰岛素耐受力也明显降低。通过口服葡萄糖耐量试验全身胰岛素敏感指数明显提高，证明杨梅素增加小鼠全身胰岛素敏感度。杨梅素改变IRS-1、p85和PI3K调节亚单位表达缺陷，增加小鼠比目鱼肌中IR、IRS-1和Akt基底的磷酸化，导致胰岛素活性降低。同时他们[76]也研究出杨梅素通过加强肥大小鼠IRS-1、PI3K和GLUT-4活性，增加后受体胰岛素信号来改善胰岛素敏感度。杨梅素对多种动物模型均具有较好的降血糖作用，可望开发出降血糖药物。

2.2.6.抗氧化作用

邹耀洪[77]通过从杨梅果核中提取分离到的杨梅素，采用Rancimat法测定其抗氧化性能，结果表明其对油脂是优良的抗氧化剂，作用明显强于合成抗氧化剂BHT(3， 5-二叔丁基-4-羟基甲基苯)可作为天然抗氧剂应用于油脂较高的食品保藏上。Shimmyo Y[78]研究表明杨梅素是一种很强的抗氧化剂，氧化应激在各种神经疾病包括局部缺血和老年期痴呆中起关键作用，ß-淀粉酶是老年痴呆患者脑中含有的老年斑中的一种成分。ß-淀粉酶-42(1 microM)诱导的小鼠原皮质神经元培养48小时，出现明显的神经损伤。DAPI染色法表明构象变化的ß-淀粉酶-42导致细胞凋亡，如核碎裂。杨梅素通过构象变化作用减少ß-淀粉酶的产生和毒性，可用于统计老年痴呆的进展情况。

2.2.7.保肝护肝作用

钟正贤[79]等采用四氯化碳、D2半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致小鼠急性肝损伤模型，观察杨梅树皮素对肝损伤的保护作用；采用小鼠单核巨噬细胞吞噬和免疫低下小鼠和溶血素试验，观察杨梅树皮素的免疫增强作用。结果证实了杨梅素能明显降低四氯化碳、D2半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST活性和T2BIL含量，减轻肝组织的变性和坏死；并提高单核巨噬细胞吞噬功能和溶血素含量。说明了杨梅树皮素具有保肝降酶退黄，增强小鼠非特异免疫功能和免疫功能低下小鼠体液免疫功能，因而起到保肝作用，为杨梅素的临

床应用提供了参考。

2.3 杨梅素抗肿瘤作用研究进展

2.3.1通过抑制细胞周期阻滞细胞增殖

Ching-Huai Ko等人研究表明杨梅素对结肠直肠癌中基质金属蛋白酶2(MMP)的表达和活性有抑制作用，通过影响蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，细胞外信号调节激酶（Erk）的磷酸化和c-Jun 的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。Zhang Q发现杨梅素具有细胞毒作用，虽然毒力较弱，但同其他黄酮类成分一样，通过使细胞停滞在G2/M导致细胞凋亡。Lu J等提出杨梅素通过抑制硫氧蛋白还原酶活性，使肿瘤细胞停滞于G1晚期，进而引起细胞死亡。

2.3.2抑制信号传导通路相关因子介导肿瘤细胞凋亡

Ki Won Lee等发现杨梅素是赘生性细胞转化和MEK1的天然抑制剂，其影响MEK信号通路具有抗肿瘤的潜力。杨梅素和白藜芦醇复合物对12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)和上皮生长因子(EGF)诱导的细胞转化没有协同作用。杨梅素减弱肿瘤启动因子(EGF)-诱导的c-fos和活化蛋白-1（AP-1）的激活作用。而白藜芦醇没有这个作用。杨梅素抑制MEK1活性很强，同时抑制TPA和EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Erk）和其下游区靶点p90核醣体S6激酶的磷酸化。此外，对比MEK抑制剂PD098059和白藜芦醇，杨梅素可以有效的抑制H-Ras诱导的细胞转化。杨梅素直接与谷胱甘肽S-转移酶MEK1结合，不与其竞争ATP位点。总之，杨梅素有抗癌活性，靶向作用于MEK信号。另据报道，杨梅素对EGF诱导的细胞转化有抑制作用，EGF可以激活PI3K/ATK和Erk信号通路。对胰腺癌细胞信号传导途径PI3K/ATK有阻滞作用。信号传导在肿瘤细胞生长、增殖和转化中起到关键的作用，杨梅素作用于多种信号传导通路的相关因子，介导肿瘤细胞的凋亡。已有资料表明，杨梅素影响MAPK信号通路下游因子Erk的磷酸化和c-Jun的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。对PI3K/Akt通路中的PI3K下游的P110也有抑制作用。同时，国外相关资料表明杨梅素可以影响细胞色素C、蛋白激酶、Bcl/Bax、caspase-9和caspase-3的正常表达。

2.3.3干扰线粒体通路导致肿瘤细胞凋亡

Wang IK发现杨梅素可以通过促进细胞色素C释放和激活caspase-9 和 caspase-3诱导白血病HL-60凋亡。同时也发现其凋亡作用与羟基基团种类和数量有关。Ko CH研究发现，杨梅素影响蛋白激酶C、细胞色素C和caspase级联反应，通过线粒体依赖和活性氧独立途径导致肿瘤细胞凋亡。研究发现C3"，C4"和C5"位羟基是杨梅素诱导凋亡的主要功能团，杨梅素可以改变线粒体膜电位，同时降低Bcl-2/Bax蛋白含量，而蛋白激酶C的相关抑制因子GF-109203X、H7等可以阻止这些作用。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。线粒体途径是肿瘤细胞凋亡的经典途径，以上研究表明杨梅素可以影响肿瘤细胞线粒体膜电位，抑制Na+、K+-ATP酶活性，影响蛋白激酶C、细胞色素C和caspase级联反应。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。