颞叶【拉莫三嗪和乙琥胺对颞叶癫痫的神经可塑性实验研究】

　　摘要：目的 探讨拉莫三嗪和乙琥胺对匹罗卡品诱导颞叶癫痫模型的行为学、脑电图以及苔藓纤维发芽的影响。方法 使用氯化锂匹罗卡品制作慢性癫痫模型，随机分为6组，正常组，模型组，拉莫三嗪低高、低剂量组，乙琥胺低、高剂量组，通过对各组进行行为学观察，脑电图记录，苔藓纤维发芽的方法评价两种药物对匹罗卡品诱导的颞叶癫痫的预防作用。结果 拉莫三嗪高、低剂量组可以有效地减少自发性癫痫发作次数，改善慢性期脑电图表现（减少尖波、棘波的频率和降低痫性波的波幅），抑制苔藓纤维的发芽。拉莫三嗪各组与模型组相比，差异有统计学意义（P0.05)，高、低剂量组间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。结论 拉莫三嗪可以预防匹罗卡品诱导的颞叶癫痫发生，减少慢性期自发性癫痫发作次数，改善脑电图，抑制苔藓纤维发芽；乙琥胺不能预防匹罗卡品诱导的颞叶癫痫发生，不能减少慢性期自发性癫痫发作次数，不能改善脑电图以及抑制苔藓纤维发芽。
　　关键词：匹罗卡品；颞叶癫痫；拉莫三嗪；乙琥胺；自发性癫痫反复发作；脑电图；苔藓纤维发芽
　　中图分类号：R742.1 R255.2 文献标识码：A 文章编号：16721349（2012）08098003
　　颞叶癫痫为成年难治性癫痫的主要类型，氯化锂匹罗卡品诱导的颞叶癫痫模型成功的复制了人类复杂部分性发作，通过注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE)形成，15 d后大鼠出现自发性癫痫反复发作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）现象，这是一个成熟的慢性癫痫模型［1］。拉莫三嗪（lamotrigine,LTG）现已广泛用于难治性癫痫的治疗，但在此模型上的实验研究目前尚无相关文献报道。乙琥胺（ethosuximide ,ESX）是失神性癫痫的首选用药， Leite等［2］在此模型上使用ESX，发现ESX不能减少慢性期大鼠自发性癫痫反复发作的次数，但并没有进一步观察脑电图和病理学变化。本实验通过行为学、脑电图、病理学等方面来评价LTG和ESX对该模型的作用，进一步为LTG 的临床治疗提供理论依据，并探索ESX对此模型的脑电影响和神经可塑性改变。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物 成年雌性SD大鼠50只，体重180 g～220 g，由山西医科大学动物中心提供，实验动物均以标准饲料喂养,自由摄食饮水,自然光照射,换气扇通风。
　　1.2 慢性癫痫模型制备 成年雌性SD大鼠，氯化锂3 mmol/kg腹腔注射，18 h～24 h后首剂腹腔注射匹罗卡品30 mg/kg，30 min后如无Ⅳ级以上发作，可每隔15 min注射10 mg/kg追加剂量，直至出现Ⅳ级以上无明显间歇的SE。实验动物痫性发作分级评价标准采用Racine(1972年)分级标准［3］选取发作级别为Ⅳ级或Ⅳ级以上者，SE持续60 min后注射地西泮10 mg/kg终止发作,终止发作后存活者视为造模成功。造模后大鼠于15 d后会出现自发性癫痫反复发作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）。
　　1.3 实验分组 随机分为模型组、正常对照组、LTG低剂量组、LTG高剂量组、ESX低剂量组、ESX高剂量组6组。模型组：使用氯化锂匹罗卡品按上述方法进行造模，造模后无药物干预；正常对照组：以相同体积的0.9％氯化钠取代氯化锂、匹罗卡品、地西泮腹腔注射，无药物干预；LTG低剂量组：造模后24 h以内给予拉莫三嗪10 mg/kg灌胃，每天2次，连续7 d给药；LTG高剂量组：造模后24 h以内给予拉莫三嗪20 mg/kg,每天2次；ESX低剂量组：造模后24 h以内给予乙琥胺25 mg/kg腹腔注射，每天2次，连续7 d给药；ESX高剂量组：造模后24 h以内给予乙琥胺50 mg/kg,每天2次。
　　1.4 方法
　　1.4.1 行为学观察 采用视屏监测大鼠24 h活动，记录大鼠出现SRS后4周的癫痫发作情况（发作强度和发作次数）。
　　1.4.2 脑电图采集 分别记录致痫后30 d的脑电图，将大鼠用25%乌拉坦麻醉，使其处于半清醒状态，固定于脑立体定位仪上，定位在海马（矢状缝旁2 mm,冠状缝后4 mm，骨膜下5 mm），用BL420F型电生理信号采集仪描记脑电活动。记录尖波，棘波，尖、棘慢复合波等痫性波的频率及波幅。
　　1.4.3 Timm 组织化学染色 SE后30 d，10%水合氯醛麻醉大鼠，经左心室分别迅速灌注生理盐水100 mL、0.4%硫化钠缓
　　冲液150 mL、4%多聚甲醛400 mL，之后断头取脑，以4%多聚甲醛固定4 h～6 h，30%蔗糖4 ℃浸泡过夜,行恒温冷冻冠状切片，切片厚度30 μm，贴附于载玻片上。每只大鼠隔5张脑片取一张组成一套,每套切片8张～10张,共8套片子。行Timm 组织化学染色方法。暗室中将切片浸入新鲜配制Timm孵育液［50%阿拉伯胶60 mL、枸橼酸缓冲液（25.5%柠檬酸+23.5%枸椽酸钠］10 mL、5.7%对苯二酚溶液30 mL和17%硝酸银2 mL），置于室温下避光染色45 min～60 min，蒸馏水洗净，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置光学显微镜下观察。光镜下行齿状回内分子层timm银染苔藓纤维发芽MFS评分［4］。评分标准 0分：未见出芽；1分：偶可见点状出芽；2分：可见点状或稀疏状出芽；3分：可见片状出芽；4分：可见高浓度的片状出芽；5分：可见连续致密浓度片状出芽。
　　1.5 统计学处理 所有数据用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及LSD组间比较。
　　2 结 果
　　2.1 行为学观察 注射匹罗卡品后大鼠均于5 min内出现外周胆碱能反应(M样作用)，如瞳孔缩小、竖毛、血泪、流涎、腹泻。5 min～15 min后出现Ⅰ级、Ⅱ级发作。17 min～37 min后出现SE的大鼠均发展为Ⅳ级、Ⅴ级连续发作。50只大鼠，4只为正常对照组，其余均造模，诱发SE并达Ⅳ级及以上的40只，造模成功率为87%。存活鼠进入2 d～4 d的毒性阶段，表现为蜷伏不动，不思饮食，极易激惹。此后行为渐趋正常。经过静默期后(SE后15 d),可观察大鼠出现Ⅰ级～Ⅴ级自发性癫痫反复发作，最初多为局部性发作如前肢阵挛或面部抽搐，很快发展至全身强直性惊厥发作，一般持续时间不超过1 min，发作均可自行终止。统计自SRS出现后1个月的发作次数（见表1）。正常对照组大鼠无惊厥发作，匹罗卡品诱导大鼠SE后，慢性期均可见大鼠有不同程度的惊厥发作，而经过拉莫三嗪的干预后，低、高剂量组均不同程度的抑制了癫痫的发作次数，并且以高剂量组更为明显。乙琥胺用药后，与模型组大鼠比较，25%的大鼠较明显地减少自发性癫痫的发作次数，38%的大鼠发作次数减少不明显，31%的大鼠发作次数明显增加。通过统计，ESX各组与模型组相比无统计学意义，并且高、低剂量组间也无统计学意义。