[大孔吸附树脂对竹叶兰中总黄酮的分离纯化] 大孔吸附树脂的洗脱

　　摘要：大孔吸附树脂分离纯化竹叶兰总黄酮的最佳工艺条件为上样液浓度２．５0 ｇ／Ｌ，上样速率３.0 ＢＶ／ｈ，洗脱剂８０％乙醇，洗脱速率３.0 ＢＶ／ｈ，洗脱剂用量４.0 ＢＶ，按此工艺条件纯化后的竹叶兰总黄酮纯度达８１．５８％。ＡＢ－８型大孔吸附树脂对竹叶兰总黄酮有较好的吸附和解吸效果。
　　关键词：大孔吸附树脂；总黄酮；分离纯化；竹叶兰
　　中图分类号：Ｓ５６７．２；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2939-04
　　
　　Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｂｙ ＡＢ－８ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ
　　
　　ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆｅｎ，ＺＨＯＵ Ｘｕｅ－ｊｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｇｏｎｇ－ｘｉｎ，ＦＵ Ｙａｎ－ｌｉ，ＧＡＯ Ｙｕｎ－ｔａｏ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００３１， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｂｙ ＡＢ－８ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｌｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ were as follows ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗas ２．５0 ｇ／Ｌ ａｎｄ ３.0 ＢＶ／ｈ respectively； tｈｅ ｅｌｕａｎｔ wａｓ ８０％ ｅｔｈａｎｏｌ； ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｎｇ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｗａｓ ３.0 ＢＶ／ｈ， and tｈｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｕａｎｔ wａｓ ４ＢＶ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Tｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ reached up to ８１．５８％ under these conditions. Tｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｄｓｏｒｂｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ ｉｎ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ ｗａｓ １６．９４ ｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＡＢ－８ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ waｓ ｆｉｔ ｆｏｒ ａｄｓｏｒｂｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎｓ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ
　　
　　竹叶兰（Ａｒｕｎｄｉｎａ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉａ）为兰科竹叶兰属植物，又名黄竹参［１］，傣药名为纹尚海［２］，主要分布于热带和亚热带地区，是一种重要的傣族解药，其药用部位主要为根茎，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛、消炎、利尿等作用［３－５］。
　　黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物。到目前为止，已经发现有５ ０００多种植物中含有黄酮类化合物［６］。对植物黄酮类化合物进行纯化以获得高纯度黄酮具有重要意义［７］。
　　大孔树脂分离技术是２０世纪６０年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔吸附树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，由于具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长等诸多优点［８］，广泛应用于中草药化学成分的提取、分离、富集和中药复方制剂去除杂质等方面［９］。
　　近年来报道了许多大孔树脂在黄酮、皂甙等天然活性物质的分离纯化方面的研究［１０，１１］。通过对大孔吸附树脂法纯化竹叶兰中总黄酮工艺进行探讨，以期得到高纯度竹叶兰总黄酮，为竹叶兰总黄酮类产品的开发和研究提供参考。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１竹叶兰竹叶兰（干品，购于西双版纳傣医医院），用前粉碎至８０目以下。
　　１．１．２试剂ＡＢ－８型大孔吸附树脂（南开大学化工厂），使用前按说明进行预处理；芦丁标准品购于Sｉｇｍａ公司，乙醇，石油醚，甲醇，５％ＮａＮＯ２溶液，１０％ Ａ１（ＮＯ３）３溶液，４％ＮａＯＨ溶液，所用试剂均为分析纯。
　　１．１．３仪器７２００型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；ＡＳ３１２０Ａ超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；层析柱；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂） ；ＴＨ２－８２Ｂ气浴恒温振荡器；ＡＬ２０４电子天平。
　　１．２方法
　　１．２．１竹叶兰粗提取液的制备［１２］准确称取竹叶兰粉末１．００ ｇ于１００ ｍＬ具塞锥形瓶中，加入１０ ｍＬ ６０％乙醇溶液，超声提取３０ ｍｉｎ后，抽滤。滤渣再用７０％的乙醇超声浸提３０ ｍｉｎ，共浸提３次。过滤后合并３次滤液，于旋转蒸发仪浓缩至干。称重，备用。用７０％乙醇溶液定容至２５ ｍＬ作为待测液。
　　１．２．２总黄酮含量的测定
　　１）对照品溶液的制备。精确称取１０５ °Ｃ干燥至恒重的芦丁对照品２０ ｍｇ，置于1００ ｍＬ容量瓶中，加８０％乙醇溶解至刻度，摇匀得浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液，备用。
　　２）标准曲线的制作［１3］。分别吸取０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０ ｍＬ对照品溶液，分别置于２５ ｍＬ比色管中，各加３０％乙醇定容至１０ ｍＬ，加５％ＮａＮＯ２溶液１ ｍＬ，摇匀放置６ ｍｉｎ，再加１０％
　　Ａｌ（ＮＯ３）３溶液１ ｍＬ，摇匀，再放置６ ｍｉｎ，加４％ＮａＯＨ溶液１０ ｍＬ，用去离子水定容至刻度，摇匀放置１５ ｍｉｎ，以去离子水作参比，用１ ｃｍ的比色皿于波长５１０ ｎｍ处测定其吸光度，以吸光度Ａ为纵坐标，以芦丁标准溶液的浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得到吸光度和芦丁标准溶液浓度的回归方程：Ａ＝１２．５４６ ０Ｃ＋０．００５ ８，ｒ＝０．９９９ ８。该方法在０．００８～０．０６４ ｍｇ／ｍＬ浓度范围内呈良好的线性关系。
　　３）总黄酮含量的测定。采用ＮａＮＯ３－Ａ１（ＮＯ３）３比色法，按照标准曲线制作的方法对竹叶兰样品溶液中总黄酮含量进行测定，得到不同条件下的吸光度值，利用芦丁标准曲线方程进行计算，从而得到测定液中的总黄酮含量。
　　１．２．３ＡＢ－８树脂的预处理［１4］大孔树脂用９５％乙醇浸泡２４ ｈ，充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，再用去离子水洗尽乙醇；用５％ＨＣｌ溶液浸泡８ ｈ，再用去离子水洗至ｐＨ值为７，接着用５％ ＮａＯＨ溶液浸泡８ ｈ，再用去离子水洗至ｐＨ值为７，浸泡于去离子水中备用。
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　　１）静态吸附量的测定。取ＡＢ－８大孔树脂１０ ｍＬ，置于１００ ｍＬ的具塞磨口三角瓶中，精密加入供试液１００ ｍＬ，密封后在振荡培养箱中恒温（２５ ℃） 振荡吸附。分别在振荡吸附０、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、１０．０、１２．０、２４．０ ｈ时取２ ｍＬ上清液测定总黄酮含量， 按下式计算树脂对总黄酮的吸附量（ｇ／L）
　　Ｑｅ＝Ｖ０（C０－Cｅ）／Ｇ
　　式中，Ｑｅ为饱和吸附量（ｇ／Ｌ）；C０为初始浓度（ｇ／Ｌ）；Cｅ为吸附后浓度（ｇ／Ｌ）；Ｖ０为样品溶液体积（Ｌ）；Ｇ为树脂量（ｍＬ）。
　　１．２．５动态吸附-解吸试验
　　１）吸附率、解吸率的测定。１０ ｍＬ大孔树脂湿法装柱，粗提液以一定流速上样，待树脂吸附饱和后，再以一定体积分数的乙醇溶液进行洗脱，根据以下公式计算吸附率和解吸率。
　　Ｅ＝（C０－Cｅ）Ｖ０／C０Ｖ０
　　Ｄ＝CｄＶｄ／（C０－Cｅ）Ｖ０
　　式中，Ｅ为吸附率；Ｄ为解吸率；C０为初始浓度（ｇ／Ｌ）；Cｅ为吸附后浓度（ｇ／Ｌ）；Cｄ为洗脱液浓度（ｇ／Ｌ）；Ｖ０为样品溶液体积（Ｌ）；Ｖｄ为洗脱液总体积（ｍＬ）。
　　２）树脂吸附泄漏曲线的测定。１０ ｍＬ大孔树脂湿法装柱，粗提液以一定流速上样，每１０ ｍＬ为１份收集滤液，检测收集液总黄酮含量，绘制泄漏曲线。
　　３）动态洗脱曲线的测定。饱和吸附的树脂，用去离子水洗脱３．０ＢＶ，再用８０％乙醇溶液以３．０ ＢＶ／ｈ的流速洗脱，每１０ ｍＬ为１份收集洗脱液，检测洗脱液总黄酮含量，绘制洗脱曲线。
　　２结果与分析
　　２．１ＡＢ－８大孔吸附树脂对竹叶兰总黄酮的静态吸附-解吸结果
　　２．１．１静态吸附动力学曲线测定不同时间ＡＢ－８大孔树脂的吸附量，绘制树脂的静态吸附动力学曲线，如图１所示。由图１可知，随着振荡吸附时间的增加，树脂对总黄酮的吸附量不断增加。当吸附时间到达１０.0 ｈ时，树脂吸附量慢慢达到饱和，吸附量的上升趋势变缓，逐渐趋于不变。因此提高吸附时间有利于提高树脂的使用效率。但考虑到吸附时间过长会导致试验时间过长，影响试验进度。因此吸附时间控制在１０.0 ｈ左右。
　　２．１．２粗提液总黄酮浓度对树脂吸附效果的影响配制浓度分别为１．００、１．５０、２．０0、２．５０、３．００、３．５０、4.00 ｇ／Ｌ的粗提液，进行ＡＢ－８大孔树脂静态吸附试验（吸附时间２４.0 ｈ），结果如图２所示。由图２可知，在样品浓度较低的条件下，随着溶液初始浓度的提高，总黄酮的吸附量迅速增加，当样品浓度达到２．５０ ｇ／Ｌ左右时，吸附量上升的趋势变缓。因此，提高上样液浓度有利于提高树脂的使用效率。但是考虑到样品浓度过高，上样液可能出现絮凝和沉淀，从而造成树脂被堵塞和污染，影响了其吸附能力。因此，上样液浓度控制在２．５０ ｇ／Ｌ。
　　２．１．３洗脱溶剂体积分数对解吸效果的影响取１０ ｍＬ饱和吸附的ＡＢ－８大孔树脂于锥形瓶中，加入１００ ｍＬ不同体积分数的乙醇溶液，进行ＡＢ－８大孔树脂静态解吸试验（解吸时间４.0 ｈ），结果见图３。竹叶兰总黄酮一般应用在食品及医药领域，因此选用乙醇作为解吸剂，考察乙醇体积分数对解吸率的影响。如图３所示，随着乙醇体积分数增加，解吸率呈先升高后下降的趋势，当乙醇体积分数为８０％时，解吸率达到８９．４３％。因此，选用８０％乙醇溶液对竹叶兰总黄酮的动态解吸进行研究。
　　２．２ＡＢ－８大孔吸附树脂对竹叶兰总黄酮的动态吸附-解吸结果
　　２．２．１上样速率对吸附率的影响大孔树脂湿法装柱，粗提液分别以１.0、２.0、３.0、４.0、５.0 ＢＶ／ｈ的流速上样，收集滤液，测流出液总黄酮浓度，计算吸附率，结果如图４所示。由图４可以看出，ＡＢ－８大孔树脂的吸附率随着流速的增加而有所降低，当上柱流速为１．０ＢＶ／ｈ时，树脂的吸附率为８５．６６％；当流速提高到５．０ＢＶ／ｈ时，其动态吸附率降至６５．５％。这是因为随着上样流速增大，料液中大多黄酮类化合物还未来得及扩散到树脂内部，就被冲出柱子，导致树脂的总黄酮吸附量有所降低。虽然较低的流速对吸附有利，但流速过低，操作时间长，在实际生产中选择上柱速率应综合考虑吸附量与效率，以３．０ ＢＶ／ｈ左右的流速进行上柱为宜。
　　２．２．４洗脱体积对解吸率的影响控制洗脱乙醇体积分数为８０％，解吸速率为３．０ ＢＶ／ｈ，考察不同洗脱体积下的解吸率，结果如图７所示。由图７可以看出，洗脱体积对洗脱效果有明显的影响。当洗脱量为１．０ ＢＶ时，解吸率只有３９．８８％；而洗脱量达4．０ ＢＶ时，解吸率升至 ８９．５６％。当洗脱量继续增加，解吸率变化甚微。因此，从节约成本角度出发，洗脱剂用量宜控制在４．０ ＢＶ左右。
　　２．２．５动态洗脱曲线的绘制对饱和吸附的ＡＢ－８大孔树脂，根据静态解吸所确定的最佳洗脱体积分数为８０％乙醇溶液，动态吸附所确定的最佳洗脱速率为３．０ ＢＶ／ｈ，每５ ｍＬ为１份收集滤液，检测收集液总黄酮含量，得到室温下乙醇溶液对ＡＢ－８树脂吸附的竹叶兰总黄酮的动态洗脱效果，洗脱曲线如图８所示。由图８可知，总黄酮容易洗脱，洗脱高峰相对集中，１．５～３．０ ＢＶ洗脱液中的总黄酮含量较高。合并总黄酮含量较高的洗脱液，冷冻干燥，纯化后的竹叶兰总黄酮纯度达８１．５８％（ｎ＝３）。
　　３结论
　　当竹叶兰总黄酮粗提液总黄酮浓度为２．５0 ｇ／Ｌ，上样速率为３．０ ＢＶ／ｈ时，ＡＢ－８型大孔树脂对竹叶兰总黄酮的吸附量较大。
　　通过静态、动态吸附-解吸试验比较，发现ＡＢ－８型大孔吸附树脂有良好的吸附性能和解吸效果，得出竹叶兰总黄酮的最佳吸附条件为：上柱料液浓度２．５0 ｇ／Ｌ，控制上柱速率为３．０ ＢＶ／ｈ。最适解吸条件为：洗脱液乙醇体积分数为８０％，解吸速率３．０ ＢＶ／ｈ，洗脱体积为４．０ ＢＶ。
　　ＡＢ－８型大孔吸附树脂对竹叶兰总黄酮具有良好富集作用，对分离纯化竹叶兰总黄酮具有可行性。
　　
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