【一种ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ｄｕｐｌｅｘ设计新技术研究】新技术研究开发费

　　摘　要：利用micmRNA数据库，获取3种微RNAmir-181a、mir-124和mir-1的成熟序列信息。基于siRNAdu-plex在形成RNA诱导的沉默复合物(RNA－induced silencing complex，RISC)过程中的不对称性的特点，初步设计了针对上述3种微RNA的microRNA duplex。采用生物学软件Oligo6．0分别评价其热动力学特性，并通过改变反义链3’端个别碱基序列使其满足热动力学的需求，从而确定最终的设计序列。结果显示，利用RISC形成过程的不对称性，结合生物学软件Oligo6．0的热动力学分析来设计mjRNA duplex，是一种简便可行、准确有效的方法。
　　关键词：微RNA；siRNA；生物信息学分析；热动力学性质
　　中图分类号：0522；Q751
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007―7847(2006)02―0109-04
　　微RNA(microRNA，miRNA)是一类长约为22nt的非编码小分子单链RNA，在动物体内，它可以通过与对应的靶序列发生不完全互补配对，从而抑制特异性的mRNA的翻译，导致相应蛋白质合成减少。随着分子克隆技术和生物信息学的不断进步，科学工作者们已经从不同物种中发现了大量的miRNA，至今已经确定的人类miRNA有222个，约占人类全基因组的1％左右，但它们却调控了20％甚至更多的基因编码产物。
　　大量的研究表明，微RNA可能在人类发育调控、细胞增殖和死亡、造血过程等多种生物学过程中发挥重要的作用。然而，在动物体内，绝大多数的微RNA的具体功能仍然不清楚，这主要是由于miRNA靶基因识别存在一定的困难。在植物中，miRNA与靶序列发生近似完全互补，因而可以直接利用生物信息学的方法进行预测。然而，在动物体内应用生物信息学来预测靶点就比较困难了，因为大多数miRNA与其靶基因间仅有7～8个左右的碱基互补，因而往往会有大量潜在的候选靶位点。但无论是对miRNA的功能进行研究，还是对其靶基因进行验证，都需要人为地使所要研究的微RNA在体内发生瞬时或者持续高表达，进而进行针对性研究，这种方法类似于采用RNA干扰的方法进行靶基因的功能及相关研究。制备siRNA较为常用的方法包括，化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNase III类降解、构建siRNAs表达载体或者病毒载体、PCR制备的siR-NA表达框等。miRNA与siRNA尽管都属于小分子非编码RNA，但由于miRNA在形成过程、作用机制等方面的差异，决定了对miRNA研究的复杂性。本文重点要介绍的是一种基于siRNAduplex在形成RISC过程中的不对称性的特点，结合生物学软件Oligo 6．0进行热动力学计算的微RNA设计新技术，并针对mir－181a、mir－124、mir－1序列信息分别设计长为22nt左右的mir-NA duplex。
　　
　　1 方法
　　1．1 在miRNA数据库中查找对应序列信息
　　为了设计特定的miRNA，首先必须获取所要研究的miRNA的序列信息。目前国际上较为权威的数据库有microRNAregistry(http：//micror-na.sanger．ac．uk/)；而国内由清华大学生物信息学重点实验室建立的microRNAdb数据库，也提供了较为完整的miRNA的相关信息(http：//166．111．30．65/micrornadb/index．php)，到目前为止共收录了732个miRNA的序列信息。利用这两个数据库，可以获得microRNA的染色体定位、起止位点、前体及成熟序列信息(如长度、序列组成、二级结构自由能)等。
　　
　　1．2 基于功能siRNA的结构特点设计miRNA
　　RNA干扰当中非常关键的一步是形成RISC。最新研究表明，siRNAduplex的两条链在掺入形成RISC过程中的机率并非均等，这体现了其在功能上的不对称性。更确切地说，就是siRNA两条链的5＇末端碱基配对的绝对和相对稳定程度，将最终决定是其中的哪一条链参与RNAi。siRNA duplex的结构决定了仅有其中一条链参与形成RISC，而另外一条链则被破坏。不对称性也是miRNA的一大特点，在其形成过程中，类似siRNA duplex样的中间产物中的miRNA链将最终参与RISC的形成，从而使得miRNA在体内发生积聚。对于一个给定的靶基因mRNA来说，所设计的siRNAduplex应使其反义链更适宜进入RISC当中，因而反义链的5＇末端的碱基配对在热动力学上要比3＇末端更弱一些，这样才能获得形成RISC过程中的不对称性(见图1)。然而，为了获得最佳siRNA的效率，在设计过程中应该考虑尽量减少GC含量、避免反向重复序列，以及正义链的第3、10、13、19位存在碱基的偏好性。总体而言，siRNA的5＇末端主要负责靶mRNA的亲和力，而3＇末端则主要促进酶的催化作用。利用上述设计思路，我们可以假设mir-NA为siRNAduplex当中的有功能链，按照上述的原则进行设计，miRNA duplex的结构要适宜RISC形成过程中的不对称性。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 miRNA成熟序列查询
　　利用microRNA registry和microRNAdb两个数据库查询所要设计的miRNA的成熟序列信息。本研究中所要设计的3种miRNA分别是人类的mill81a、mir－1、mir－124。在数据库中查询其分别对应的miRNA的ID名称，如hsa-miR-181a等。所查得的3种miRNA的成熟序列信息，见表1。
　　
　　2．2 根据RISC形成过程中的不对称性原理分析所设计的miRNA
　　根据数据库中所给出的3种miRNA的成熟序列信息，我们分别对其5＇末端和3＇末端的序列进行分析，初步设计了3种21～23nt的miRNAduplex，见表2．同时，利用Olig06．0软件及最邻近法(thenearestneighbormethod)来计算互补区的内部稳定性，并绘制相应热动力学曲线图，见图2．由图可见，初步设计的人类的mir-18la、mir-124的正义链5＇末端的内部稳定性明显低于3＇末端，也就是在RISC形成之初，双链复合物从正义链的5＇端解链更容易。因此，这两种miRNAduplex的设计满足上述不对称性的原理。而初步设计的mir－1的热动力学特征提示其正义链的5＇端相比于其3＇端结合得更牢固。考虑此原因，我们将其反义链5＇端的第19号位置上的碱基C(对应于正义链5＇端的第2号位置上碱基C)变为A(C→A)，形成不完全的G-A配对，从而改变了正义链5＇端的解链的难易度。这种单个碱基的突变 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 同样也可以决定siRNAdulex对靶基因的抑制效率。最终的确定的miRNAduplex序列，见表2。
　　
　　
　　
　　3 讨论
　　
　　目前，对于微RNA的功能研究，主要还是通过构建相应的miRNAs表达载体得以实现。Zeng等利用分子克隆技术将能够表达miR-30的表达框克隆到pCMV质粒中，构建了稳定表达的pCMV－miR-30质粒，该质粒可以在RNA聚合酶Ⅱ的作用下表达miR-30。而Chen等采用类似的方法构建了依赖RNA聚合酶Ⅲ的逆转录病毒表达质粒，在不同细胞中表达了几种与造血功能有相关的miRNAs(包括miR-223、mir-181、mir-142)。尽管如此，构建某一个miRNA的表达载体并非易事，更何况microRNA家族成员已经如此庞大，且又存在物种间的差异。因此，有必要找到一种便捷、且行之有效的方法，加快对于微RNA功能的进一步研究。
　　前面提到，siRNA的制备可以有多种方法，但化学合成法一直被认为是最可靠而便捷的方法。Elbashir等研究发现3＇端带有2个突出碱基的2Int的siRNA在诱发序列特异性mRNA降解中最为有效。因此，也有不少研究者试图采用直接合成的方法来研究微RNA的功能。尽管可以借鉴siRNA设计的一些原则，但微RNA的设计又有其自身的特点，本研究讨论了一种简单、方便的微RNA设计方法。我们利用RISC形成过程中的不对称性与siRNA功能性之间的关系，同时在设计miRNAduplex的过程中，互补区的内部稳定性直接决定了miRNA的功能性。采用Oligo6．0软件及最邻近法对互补区的热动力学特点进行评价，从而对某些不合适的位点进行调整，以获得功能性的miRNAduplex。当然，这种调整并非是固定了，在设计中可以灵活运用。
　　对于理论上所设计的微RNA的有效性，还需要实验来进一步验证。Lim等通过基因芯片技术研究了几种化学合成的miRNA及其靶向的mRNA，也证实了化学合成方法的有效性。我们采用生物信息学的方法对上述实验中的几个微RNA进行分析，结果满足热动力学的要求。同时，我们利用这种方法设计并合成mir-181a du-plex，转染K562细胞，进而对mir―181a的功能和靶基因进行了预测和分析，也取得了较好的结果(结果尚未发表)。由此可见，利用该方法来设计特定的miRNA，不仅是一种简便可行、准确有效的方法，而且将有助于加快miRNA的功能及相关研究。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文