松果体囊肿_羊松果体细胞原代培养及其生物学特性的研究

　　摘 要：体外培养山羊及绵羊的松果体细胞，观察其增殖情况和功能状态的变化。结果显示：山羊、绵羊的松果体细胞体外形态及生长情况相似。细胞多呈圆形或多角形，细胞体积有增大趋势。采用MTT了法检测细胞生长状态，发现细胞有明显的增殖现象，大约于11 d达到高峰，用免疫组织化学对培养细胞进行染色， 发现5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。表明山羊和绵羊松果体细胞在体外均增殖旺盛，并能保持体内的分泌功能。
　　关键词：松果体细胞培养；M9了；5-HT免疫组化
　　中图分类号：S827
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007―7847(2006)01―0087―04
　　松果体为哺乳动物的重要神经内分泌器官， 产生多种胺类和肽类物质，其主要分泌物--褪黑 素(MT)对许多器官的功能具有重要的调节作用。 为了解松果体的生理价值，许多学者采用体外培 养技术研究其细胞形态和分泌功能．体外构建松 果体组织并植入动物体内成为目前研究的热点， 这些研究有助于深入了解松果体的活动特点，为 进一步调节动物体内松果体细胞分泌的研究积累 材料。
　　哺乳动物松果体细胞培养早在20世纪70年 代国外就有报道，1977年Rowe首次观察了体外 培养大鼠松果体细胞的形态，1978年Budat成功 检测了培养的大鼠松果体细胞褪黑素合成和分泌 功能。本实验以山羊和绵羊作为研究对象，对其 松果体进行体外培养，观察在无其他因素干扰条 件下山羊和绵羊松果体细胞的形态变化、增殖过 程和功能状态的异同，为研究松果体细胞分泌特 点及改变动物繁殖现状提供依据。
　　
　　l 材料与方法
　　1.1 主要实验试剂及仪器
　　DMEM培养液(GIBCO，美国)，M199培养液 (sigma，美国)，犊牛血清(sigma，美国)，胰蛋白酶 (sigma，美国)，双抗(武汉亚法)，MTr(sigma，美 国)，DMSO(国产分析纯)，兔抗5-HT血清(武汉 博士德)，SABC试剂盒(武汉博士德)，DAB显色 试剂盒(武汉博士德)，自动酶标仪(Tecan，澳大利 亚)，C02培养箱(LAB―LINE，美国)，倒置显微镜 (Nikon，日本)。
　　
　　1．2 松果体细胞的体外培养
　　按伊斯兰方法屠宰1岁龄健康莱芜黑山羊6 只、小尾寒羊5只，分别进行以下步骤：迅速开颅取 出松果体，冷D-hank昌液冲洗；剪碎后，0．25％胶 原酶消化30min，含血清培养液中和，反复吹打， 离心；加完全培养液吹打混匀，按每mL 1xl04的 细胞密度分别接种于96孔培养板(分7组，每组6 孔)和24孔板(分7组，每组3孔，每孔内置一盖玻 片)，放人37℃、5％C02培养箱内培养。另外，本
　　实验中山羊采用DMEM培养液，绵羊采用M199 培养液。
　　
　　1．3 MTT法检测细胞增殖
　　从培养第3d开始，隔日取96孔板内一组细 胞，每孔加入MTY 15 μL，继续培养4h后，每孔 加入DMSO 30 gL，吹打至沉淀完全溶解后，在 0D570。处测吸光度值并绘制曲线。
　　
　　1．4 5－HT免疫组织化学方法 24孔板每组从第3d开始隔日取出细胞爬 片，PBS冲洗，冷95％乙醇固定10min；用正常羊 血清在室温下封闭30rain；加入兔抗5―HT血清 (1：100)37℃孵育2h，然后4℃过夜，PBS冲洗3 rainx3；加入生物素标记的IgG，37℃ 30min， PBS冲洗3minx3；SABC复合物37℃下作用30 rain，PBS洗3 minx3；DAB镜下显色5～10Min； 苏木素复染，脱水，透明，封片观察。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 松果体细胞的形态观察
　　倒置显微镜观察体外培养的山羊、绵羊松果 体细胞形态相似，大多呈圆形或多角形，x400下 观察呈圆圈状。培养过程中都可见到“8”形的细 胞形态，可能为正处于细胞分裂期。培养后期，细 胞体积略增大，折光性减弱，但形态变化不大。另 外可见具有长突起的小胶质细胞(图1、2)。
　　
　　2．2 MTT检测结果
　　从表1和图3可以看出，体外培养的松果体 细胞数量前7d增长缓慢，第9d开始分裂增殖速 度加快，于第11d左右达到高峰，此后生长曲线 开始缓慢下降。
　　
　　2．3．5-HT免疫组化染色结果
　　不同培养时期都可见细胞爬片上布满棕黄色 的5-HT阳性细胞，培养后期细胞的阳性反应仍 然明显，松果体细胞多呈圆形或多角形，高倍镜 下细胞中阳性物质呈不均质分布，细胞轮廓无明 显界限，复染后核位于细胞中间，呈规则的圆形 (图4、5)。培养前期随时间延长，阳性细胞数有增 加现象；在11d细胞增殖达高峰后，阳性细胞数 量变化不大。
　　
　　3 讨论
　　
　　1)体外条件下培养山羊、绵羊的松果体细胞 形态相似，初期呈小圆形、折光性强，后期细胞逐 渐增大、折光性减弱，这与廖华对大鼠松果体 细胞的报道基本一致。
　　2)MTT比色法是一种检测细胞增殖情况的 经典方法，酶标仪所测的OD值可反映出细胞的 相对数量。从测量OD值得出的生长曲线可 见，两种羊虽在不同培养液中生长，但其增殖趋势 相同，松果体细胞在培养第9d开始增殖，11d左 右达到高峰，随后增长缓慢。证明松果体细胞在 常规培养条件下，能保持其增殖能力，细胞数目明 显增加，而在成年动物体内，松果体细胞与神经 元一样，数目恒定且很难再生。对于一特定动 物来说，随着年龄的增长松果体细胞开始退化，同 时也没有新生的细胞出现，因此松果体这一器官 将逐渐衰老而无法发挥其功能。本实验发现体外 松果体细胞表现出明显的增殖现象，说明体外构 建松果体组织用于解决细胞的更新问题渴望成为 可能。
　　3)褪黑素是松果体细胞的主要分泌物，而它 是由色氨酸在多种酶的作用下转化而成，因此检 测转化过程中的任一中间产物或酶都可反映细胞 的功能状态，本实验采用目前常用的5―羟色胺 免疫细胞化学染色，因为5-羟色胺作为MT的前 体与MT的分泌有着密切的关系，可初步判断松 果体细胞的功能状态。我们对培养不同时期的 细胞爬片进行抗5―羟色胺免疫细胞化学染色，发 现爬片上布满阳性细胞，细胞中含有大量呈点状 的阳性颗粒，细胞多为圆形和不规则形，阳性细胞 数量随细胞总数的增加而增加。证明体外增殖的 松果体细胞具有合成5－HT，分泌MT的能力。
　　4)本研究所选的实验动物山羊、绵羊均为季 节性繁殖动物，光周期是影响其生殖活动的主要 环境因素。松果体分泌的褪黑素在光周期感受 过程中处于调控的中心地位，褪黑素主要通过 与下丘脑-垂体―性腺轴的相互作用达到动物生 殖周期与环境光周期的同步变化。实验证明体 外构建的松果体组织具有旺盛的增殖和分泌能 力，因此可以考虑给动物植入新的松果体，并人为 控制细胞的分泌状态，延长动物的繁殖季节，以达 到增加繁殖率的目的。同样其它季节性繁殖动物 如藏羚羊等濒临灭绝物种也可采用该方法来提高 种群数目。通过本课题的研究，我们可以为人工 繁殖稀有动物提供一个新的思路。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文