[新城疫病毒TS09耐热株HＮ基因的序列测定与分析]基因七型新城疫

　　摘要：新城疫病毒ＴＳ０９耐热株是由Ｖ４株经耐热选育得到的新毒株。对其血凝素－神经氨酸酶（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＨＮ）基因进行序列测定分析。选取ＧｅｎBａｎｋ中国内外具有代表性的序列与其进行同源性和系统进化分析。结果表明，氨基酸序列同源性比较中，ＴＳ０９耐热株与Ｖ４株的氨基酸的同源性为９６．８％；在核苷酸系统进化树中，Ｖ４株位于基因Ｉ型的分支上，ＴＳ０９耐热株位于基因ＩＩ型的分支上；耐热株中ＨＮ基因中ＧＣ含量为４７．５８％，比不耐热株ＧＣ含量高；但比较耐热株和不耐热株ＨＮ蛋白的α螺旋，耐热株比不耐热株的ＨＮ蛋白在跨膜区和胞外区均多出一个长的α螺旋。同源性和系统进化分析表明ＴＳ０９耐热株与Ｖ４株有很近的亲缘关系；耐热株和不耐热株ＨＮ蛋白的ＧＣ含量、α－螺旋有很大的差别，这可能与耐热性有一定的关系。
　　关键词：新城疫病毒；ＴＳ０９耐热株；ＨＮ基因；序列测定；耐热分析
　　中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2543-03
　　
　　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＮ Gｅｎｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ ＴＳ０９
　　Hｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Sｔｒａｉｎ
　　
　　ＳＨＡＮＧ Ｙｕ１，ＳＨＡＯ Ｈｕａ－ｂｉｎ２，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｌｉｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｕｎ２，ＨＵ Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｇｕｏ－ｆｕ１，ＷＥＮ Ｇｕｏ－ｙｕａｎ２
　　（１． Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｃａｄｅｍｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｉｎｓｉｔｕｄｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs， Ｗｕｈａｎ ４３０２０９， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｉｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｂｙ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ． Ｉｔｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ-ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ （ＨＮ） ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ． Dｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎBａｎｋ were selected ｔｏ ａｎａｌｙze ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙｌｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＮ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ９６．８％ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｇｅｎｅｔｙｐｅ ＩＩ ａｎｄ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｇｅｎｅｔｙｐｅ Ｉ． Ｔｈｅ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ＨＮ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｓ ４７．５８％ ｔｈａｔ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｔｈｅ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｖｅ ｔｗｏ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ，ｏｎｅ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｖ４ ｓｔｒａｉｎ ａｒｅ ｖｅｒｙ ｃｌｏｓｅ． ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ α ｈｅｌｉｘｅｓ ｏｆ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｅ ｖｅｒｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ hｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ thermolabile ｓｔｒａｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ representate ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ； ＴＳ０９ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； ＨＮ ｇｅｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ； ｔｈｅｒｍａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
　　
　　新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）是由新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）引起的禽类急性烈性传染性疾病，每年给国内外的养殖业带来了巨大的经济损失。ＮＤＶ属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，其基因组有１５ １８６、１５ １９２和１５ １９８个核苷酸三种长度［１，２］，有六个大的开放阅读框，编码６个主要蛋白（即ＮＰ核蛋白，Ｐ磷蛋白，Ｍ基质蛋白，Ｆ融合蛋白，ＨＮ血凝素－神经氨酸酶和Ｌ聚合酶）［３］。Ｆ蛋白和ＨＮ蛋白是ＮＤＶ的两种囊膜糖蛋白，它们与ＮＤＶ的致病性和免疫原性密切相关。ＨＮ蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在ＮＤＶ侵染宿主细胞的过程中，ＨＮ蛋白能识别、吸附受体，并且能促进Ｆ蛋白与胞膜的融合。在不同的毒株中，ＨＮ基因的长度大小不一，其长度范围在１ ７１６～１ ８５１ ｎｔ，编码的蛋白质长度也随之变化。
　　新城疫在我国属于强制性免疫疫病。目前，市场上使用的疫苗有活疫苗和灭活疫苗两种，活疫苗包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗。这些疫苗各有缺点：中等毒力株活疫苗有较强的毒副反应，且有出现毒力返强的风险［４］；低毒力活疫苗冷藏条件要求高，常因保存或使用不当而影响疫苗免疫效果；灭活疫苗需要肌肉注射，费工费时，免疫成本高，且影响禽肉品质。因此，研制无毒耐热活疫苗在防控新城疫方面有很重要的意义。ＮＤＶ Ｖ４株是澳大利亚学者Ｓｉｍｍｏｎｓ从８周龄有溃疡的鸡腺胃中分离的１株自然无毒耐热毒株，１９８８年，我国从澳大利亚引进该毒株，并对其部分生物学特性进行了研究，结果表明引进的Ｖ４株免疫鸡群后，ＨＡ抗体水平十分不一致，因而影响免疫鸡群的保护率。随后国内一些学者结合我国的实际进行了多方面的研究，并培育筛选出新的克隆株［５－７］。
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　　１材料与方法
　　１．１毒株
　　ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所对ＮＤＶ Ｖ４株经耐热选育后获得，为鸡胚尿囊液，鸡胚半数感染剂量（ＥＩＤ５０）为１×１０９．７／ｍＬ。
　　１．２试剂
　　主要仪器和试剂：ＰＴ－２０００ ＰＣＲ仪、Ｍｏｄｅｌ ３０００Ｘｉ电泳仪购自ＢｉｏＢＡＤ公司；Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、琼脂糖购自ＯＭＥＧＡ公司；Ｔｒｉｚｏｌ裂解液购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶和随机引物购自上海宝生物公司；Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（５０）购自上海华舜生物技术有限公司；氯仿等试剂为分析纯试剂。
　　１．３引物设计
　　参考Ｇｅｎｂａｎｋ上与ＮＤＶ Ｖ４株ＨＮ基因相似度最高的序列（序列号为ＡＹ９３５４９３），设计了两对引物。两条扩增片段之间有７２ ｎｔ的重叠区，覆盖了整个ＨＮ基因区域以及其上游下游部分序列。两对引物的序列为：
　　Ｆ１：５′－ＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＧ－３′
　　Ｒ１：５′－ＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣ－３′
　　Ｆ２：５′－ＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧ－３′
　　Ｒ２：５′－ＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣ－３′
　　由上海博尚生物有限公司合成。
　　１．４病毒ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成
　　根据ＲＮＡ提取试剂盒说明书提取病毒全基因组ＲＮＡ。病毒ＲＮＡ样品用４０ μＬ的ＤＥＰＣ水溶解。取１７ μＬ ＲＮＡ样品和１ μＬ随机引物在７０ ℃水浴５ ｍｉｎ，立即冰浴；加入５ μＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ，１．５ μＬ ｄＮＴＰｓ，０．５ μＬ Ｍ－ＭＬＶ，混匀后４２ ℃ ６０ ｍｉｎ；９５ ℃ ５ ｍｉｎ；冰浴，待进行ＰＣＲ扩增。
　　１．５ＰＣＲ扩增及产物纯化
　　取１ μＬ ｃＤＮＡ作为模板进行ＨＮ基因的ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ体系为：５ μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋），１ μＬ ｄＮＴＰｓ，１ μＬ上游引物，１ μＬ下游引物，１ μＬ模板，０．５ μＬ Ｔａｑ酶，４０．５ μＬ Ｈ２Ｏ；ＰＣＲ反应条件为：９５ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ，５２℃ ４５ ｓ，７２ ℃ ２ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物以１％琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，切下目的片段，用Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ纯化回收ＤＮＡ。
　　１．６序列测定与分析
　　纯化的ＰＣＲ扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行序列测定。对ＴＳ０９株以及由Ｇｅｎｂａｎｋ（美国国家生物信息数据库，ＮＣＢＩ）检索获得到的２５株ＮＤＶ ＨＮ基因序列（其具体信息见表１）进行同源性和遗传进化分析。氨基酸同源性分析采用ＤＮＡｓｔａｒ软件包中的Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序。遗传进化分析采用ＭＥＧＡ４软件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ，４．０版本），具体参数设置参照文献［１２］进行。
　　２结果
　　２．１ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株ＨＮ基因的扩增
　　分别以引物对（Ｆ１；Ｒ１）、（Ｆ２；Ｒ２）扩增出１号和２号片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图１，由图１可得，两条目的条带均在２ ０００ ｂｐ左右，与预期的大小（１号２ ０８５ ｂｐ和２号２ ０９５ ｂｐ）相符。
　　２．２ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株ＨＮ基因序列测定
　　对ＰＣＲ产物进行纯化及序列测定后，将两条序列进行拼接，获得ＮＤＶ ＴＳ０９株ＨＮ基因的全长序列。该基因全长为１ ７３４ ｎｔ，编码由５７７个氨基酸残基组成的多肽。推导的蛋白质分子量为６２．８ ｋＤ，等电点为６．６４。
　　２．３ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株ＨＮ基因的氨基酸同源性分析
　　应用ＤＮＡｓｔａｒ软件包中的Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序，对包括ＴＳ０９耐热株在内的２６株ＮＤＶ ＨＮ基因进行氨基酸同源性分析。结果表明，ＴＳ０９耐热株与其余２５株ＮＤＶ ＨＮ蛋白的氨基酸同源性为８７．６％～９６．８％。ＴＳ０９株与Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ株的同源性最高，均为９６．８％；与ＨＢ９２株的同源性为９６．７％。
　　２．４基于ＨＮ基因的遗传进化分析
　　应用ＭＥＧＡ４软件，对包括ＴＳ０９耐热株在内的２６株ＮＤＶ ＨＮ基因进行遗传进化分析，得到图２。由图２可得，２６个ＮＤＶ毒株依据其亲缘关系的远近，可分为７个基因型。毒株的基因分型结果与表１中所描述的分型结果一致，表明进化树构建成功。分析ＴＳ０９耐热株与其亲本Ｖ４株的亲缘关系：Ｖ４株属于基因Ｉ型，而ＴＳ０９耐热株则位于基因ＩＩ型的单独一个分支上，与Ｌａｓｏｔａ、Ｂ１等ＩＩ型代表株亲缘关系较远。结果表明，经过长期耐热选育，ＴＳ０９耐热株已经由原有的基因Ｉ型进化为基因ＩＩ型。
　　２．５ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株ＨＮ基因以及蛋白质α螺旋分析
　　比较４株ＮＤＶ耐热株（ＴＳ０９、Ｉ－２、Ｉ－２ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ和Ｖ４）和４株非耐热毒株（Ｃｌｏｎｅ３０、Ｌａｓｏｔａ、Ｂ１和Ｍｅｘｉｃｏ）ＨＮ基因ＧＣ含量和疏水性氨基酸含量，结果显示耐热毒株ＧＣ含量明显比不耐热毒株高（表２）。
　　比较上述８株ＮＤＶ毒株的ＨＮ蛋白α螺旋时发现，耐热毒株ＨＮ蛋白在跨膜区域里面有一个较长的α螺旋（位置大约在３９－５１氨基酸），而不耐热株没有或很短；耐热株ＨＮ蛋白在胞外区（２８０－２９８氨基酸区）有一个大的α螺旋（ＴＳ０９株除外），而不耐热株在这个区域只有一个或两个较小的α螺旋（图３）。
　　３讨论
　　ＮＤＶ ＨＮ蛋白是一种跨膜蛋白，ＨＮ蛋白的主要疏水区在Ｎ端，１～２６氨基酸残基为囊膜内区，２７～４８氨基酸残基是跨膜区，其余为膜外区。ＴＳ０９耐热株与其他２６株ＨＮ蛋白氨基酸序列同源性为８７．６％～９６．８％，与Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ和ＨＢ９２株同源性较高（达９６．７％以上），这在一定程度上表明ＴＳ０９耐热株与Ｖ４、Ｌａｓｏｔａ和ＨＢ９２株有一定的亲缘关系。有研究表明，ＨＮ蛋白的差异主要集中在１～８０氨基酸上，８１位以后变异相对较少［８］，因此前８０位氨基酸的相似性可以很大程度上说明毒株之间的亲缘关系。在比较ＴＳ０９耐热株ＨＮ蛋白前８０个氨基酸与其他毒株的相似性时发现，ＴＳ０９株ＨＮ蛋白前８０个氨基酸与Ｖ４株ＨＮ蛋白前８０个氨基酸的相似性达到１００％（其他数据未列出）。这进一步证实了ＴＳ０９耐热株与Ｖ４株具有较近的亲缘关系。在基于ＨＮ基因的遗传进化分析中，由Ｖ４株选育得来的ＨＢ９２株和ＴＳ０９耐热株位于同一分支上（ＩＩ型），而Ｖ４株却在Ｉ型的分支上。由此表明，在耐热选育的过程中，ＨＮ蛋白存在一定程度的变异，其基因型也随之发生由Ｉ型到ＩＩ型的改变。在ＩＩ型的分支中ＴＳ０９耐热株有单独在一分支上，而ＨＢ９２和Ｃｌｏｎｅ３０、ＬａＳｏｔａ、Ｂ１株位于另一分支上。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　ＴＳ０９耐热株ＨＮ基因长１ ７３４ ｂｐ，编码５７７个氨基酸，而Ｖ４株ＨＮ基因长１ ８５１ ｂｐ，编码６１６个氨基酸。比对发现，缺失的长度全部在ＨＮ蛋白的末端，也就是膜外区的末端。这可能是由于选育压力导致的，ＨＮ蛋白暴露在膜外的部分较大，末端的部分缺失可以减小蛋白在膜外的体积，使其结构更趋稳定，这大概是ＴＳ０９耐热株比Ｖ４株耐热性更好的原因。有学者认为ＨＮ蛋白对耐热没有太大作用［９］，但我们的耐热试验结果表明，ＴＳ０９耐热株和Ｖ４株在５６℃水浴中温育２ ｈ后，依旧具有一定的血凝活性，而对照Ｌａｓｏｔａ株则完全丧失血凝活性，表明ＴＳ０９耐热株和Ｖ４株ＨＮ蛋白具有耐热性。
　　研究表明部分疏水性氨基酸随ＧＣ含量增加而增加［１０］，疏水性氨基酸的增加可以增加蛋白质的结构紧密性，从而使蛋白质结构更趋向稳定［１１］。比较耐热株和非耐热株时发现前者ＧＣ含量显著高于后者，但统计数据得到疏水性氨基酸含量并不与ＧＣ含量呈正相关。可见，ＨＮ蛋白的耐热性增加并不依赖于疏水性氨基酸的增加，ＧＣ含量的增加，可能是通过其他途径增加ＨＮ的耐热性。在分析ＨＮ蛋白中的α螺旋时发现，耐热株普遍比不耐热株多两个长的α螺旋，其中一个在跨膜区，这可能促进跨膜区蛋白质的稳定，有利于蛋白镶嵌在膜上，从而促进耐热；另一个在胞外区，这可以促进胞外区的蛋白的稳定，有利于维护蛋白的空间构象，保护功能区不受破坏，从而增加了ＨＮ蛋白的耐热能力。
　　综上所述，由氨基酸同源性分析可知ＴＳ０９耐热株与亲本Ｖ４株又很近的亲缘关系，但进化树分析表明两株之间存在一定的变异。蛋白质二级结构分析结果表明，发现耐热株和非耐热株ＨＮ蛋白α螺旋存在一定的差异，这可能是ＨＮ蛋白耐热的部分因素。但病毒的耐热的机制是很复杂的，不但与核酸和蛋白质的组成以及蛋白质的二级结构和三级结构有关，还与蛋白质与蛋白质之间的相互作用等因素有关。该研究的后期工作是对ＮＤＶ ＴＳ０９耐热株的全基因组进行测定，从全基因组的角度分析耐热毒株和不耐热毒株之间的差异，进一步推动病毒耐热机制的研究。
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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