篦子三尖杉内生真菌gyzy-9的鉴定及其抑菌活性研究:篦子三尖杉
摘要：为研究濒危药用植物篦子三尖杉（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ）内生真菌ｇｙｚｙ－９的发酵产物及其抑菌活性，对其发酵产物进行了ＨＰＬＣ分析，并对其抑菌活性进行了纸片法检测，同时还对菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列进行了聚类分析。ＨＰＬＣ分析结果表明，菌株ｇｙｚｙ－９能够产生高三尖杉酯碱（Ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ），其发酵液对表皮葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、提取物对枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的抑菌效果较强，抑菌圈直径均大于１５ ｍｍ。对ｇｙｚｙ－９菌株ＩＴＳ序列的系统发育聚类分析结果表明，ｇｙｚｙ－９为平革菌属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ．）真菌。对此菌株的研究为进一步研发生产三尖杉药用活性成分提供了条件。
关键词：篦子三尖杉；内生真菌；高三尖杉酯碱；高效液相色谱
中图分类号：Ｒ９３；Ｑ９３９．９３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2449-04
Identification and Antimicrobial Activity Analysis of Endophytic Fungi Strain
gyzy-9 from Cephalotaxus oliveri
ＨＡＮ Ｊｉｅ１，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ－ｈｏｎｇ２
（１． Ｌａｂ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ the ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｔｒａｉｎ ｇｙｚｙ－９ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ， ａ ｒａｒｅ ａｎｄ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｐｌａｎｔ， ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ） ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｙｚｙ－９ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＨＰＬＣ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｙｚｙ－９ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ． Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｆｅｒｍｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｐｅｌｌｅｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ was ｓｔｒｏｎｇｅｒ as ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ was wider ｔｈａｎ １５ ｍｍ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｙｚｙ－９ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ． ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ waｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉ Ｍａｓｔ； endophytic fungus； homoharringtonine； HPLC
植物内生菌是一种多样性十分丰富的微生物类群，生活在健康植物组织内部，与宿主植物长期协同进化，在与宿主植物长期共存的过程中，能形成产生与宿主植物相同或相似生物活性物质的能力。药用植物内生真菌活性成分的研究，如小檗碱［１］、紫杉醇［２］、细胞松弛素［３］、鬼臼毒素［４］、长春新碱［５］、喜树碱［６］等已有相关报道。
三尖杉属植物（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｓｐｐ．）为珍稀药用植物，其种子和枝叶是生产抗白血病药物三尖杉酯碱（ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎ，ＨＲＴ）和高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎ，ＨＨＴ）的原料［７］。但是，药用植物资源的短缺和滥砍滥伐的破坏，限制了以三尖杉为原料的酯碱类药物的生产。对三尖杉内生菌及其活性物质的开发利用，可以弥补资源短缺、保护生态平衡，并且能够通过对其代谢产物中活性物质的提取，降低生产成本。在前期已从濒危药用植物篦子三尖杉的枝叶中分离出了２０多株内生真菌的基础上，该试验通过ＨＰＬＣ分析获得了１株产高三尖杉酯碱的内生真菌菌株ｇｙｚｙ－９，并对其进行了分子鉴定及产物抑菌活性分析，为进一步挖掘三尖杉内生真菌发酵产物的药用活性物质打下基础。
１材料与方法
１．１材料和试剂
内生真菌ｇｙｚｙ－９分离自篦子三尖杉植株，保存于贵阳中医学院微生物教研室；高三尖杉酯碱标准品购自陕西辰光生物公司；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腐生葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、表皮葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、产气杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ）、变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）均由贵阳医学院微生物教研室提供，菌种存于贵阳中医学院形态实验室。
超声波细胞破碎仪（宁波新芝，ＪＹ０２－２Ｄ）；高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ）（日本，Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０Ａ），检测器ＳＰＤ－２０Ａ，Ｃ１８色谱柱２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ；色谱纯甲醇为天津大茂试剂；水为０．４５ μｍ滤膜过滤的蒸馏水；其他试剂为市售分析纯。ＰＤＡ培养基和ＮＡ培养基按常规方法配制。
１．２方法
１．２．１发酵产物提取和ＨＰＬＣ分析将分离的内生真菌ｇｙｚｙ－９接种至装有１００ ｍＬ液体ＰＤＡ培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，室温下１３０ ｒ/min振荡培养，７ ｄ后用超声波细胞破碎仪破碎发酵液中的菌丝球，时间为４ ｍｉｎ，打击时间４ ｓ，间隔时间４ ｓ，功率４００ ｗ。将经超声波处理后的发酵液５ ０００ ｒ/min离心１５ ｍｉｎ后取上清液，在６０ ℃水浴中浓缩至原体积的１／２０，加无水Ｎａ２ＣＯ３调ｐＨ值为９，加入二氯甲烷达原始上清液体积后充分混合静置１ ｈ以上，５ ０００ ｒ/min离心１５ ｍｉｎ，取下层沉淀，自然挥发干，得到提取物。将提取物用５ ｍＬ甲醇溶解定容。对各菌株发酵产物提取物中的生物碱进行分析，ＨＰＬＣ流动相ＣＨ３ＯＨ∶Ｈ２Ｏ（体积比）＝２∶３，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，进样量１０ μＬ，柱温３０℃，运行时间１５ ｍｉｎ。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 １．２．２ＩＴＳ 序列扩增发酵培养的菌丝球经抽滤至干后，加液氮快速研磨，然后用ＤＮＡ 提取试剂盒提取ＤＮＡ，分光光度计法测定ＤＮＡ纯度和浓度。采用引物ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′） 和ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）扩增ＩＴＳ区。ＰＣＲ反应体系：ＤＮＡ聚合酶２．５ Ｕ，１０×ＰＣＲ缓冲液５ μＬ，ｄＮＴＰ ２ μＬ，引物各２ μＬ，模板ＤＮＡ ２ μＬ，加水至５０ μＬ。反应条件为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延长１０ ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，电泳产物直接送生工生物工程（上海）有限公司测序。
１．２．３ＩＴＳ序列分析将测定所得的ＩＴＳ序列在ＧｅｎBａｎｋ用Ｂｌａｓｔｎ进行同源性比较，选择同源性较近的序列构建系统发育树。应用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １．８３ 对选择的序列进行排列，再用Ｓｅｅｖｉｅｗ将排列结果中的冗余序列剔除，最后输入Ｍｅｇａ ４．０ 软件，采用邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－jｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）构建系统发育树，自展法检测其可靠性，自展数据集为１ ０００次。根据内生真菌的形态特征和ＩＴＳ序列系统发育树，对内生真菌进行种属分类和多样性分析。
１．２．４抑菌试验将菌株接种至装有５００ ｍＬ液体ＰＤＡ培养基的１ ０００ ｍＬ三角瓶中，室温下１３０ ｒ/min振荡培养，７ ｄ后取发酵液上清液，浓缩至５ ｍＬ备用。菌丝球超声波破碎后加等体积甲醇，无水Ｎａ２ＣＯ３调ｐＨ值为９，４ ℃冰箱过夜，浓缩至５ ｍＬ备用。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌分别制成１×１０５～１×１０７个／ｍＬ菌悬液，取３０ μＬ加入无菌ＮＡ培养基中用涂布棒将其均匀涂布，制成含菌平板，然后将无菌纸片（Φ＝６ ｍｍ）放入发酵液和提取液中浸泡３０ ｍｉｎ后，均匀分散放置于含菌平板上。每个平板放５片滤纸片。将制备好的平板置于３７ ℃恒温培养１８ ｈ后观察，测其抑菌圈直径。
２结果和分析
２．１高三尖杉酯碱色谱分析
对６０ μｇ／ｍＬ的高三尖杉酯碱标准品在２９１ ｎｍ波长下进行ＨＰＬＣ分析，发现高三尖杉酯碱标准品的峰型对称，响应值较高，保留时间为２．５３２ ｍｉｎ（图１ａ）。经连续进样５次分析，保留时间的ＲＳＤ为１．１４％，稳定性和精密度较好。将分离自叶片的ｇｙｚｙ－９菌株的发酵产物进行ＨＰＬＣ分析发现在２．５３６ ｍｉｎ（图１ｂ）出现与高三尖杉酯碱标准品的保留时间基本一致的吸收峰，表明ｇｙｚｙ－９菌株的发酵产物含有高三尖杉酯碱成分。
２．２菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列聚类分析
利用通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４对内生真菌ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列进行ＰＣＲ扩增，获得６１８ ｂｐ的单一ＤＮＡ条带，测序结果提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行Ｂｌａｓｔｎ检索，发现菌株ｇｙｚｙ－９与平革菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔ ｅｓｏｒｄｉｄａ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＵ０４７８０６）的ＩＴＳ序列覆盖率达到９８％，同源性高达９７％。选取同源性较高的序列与菌株ｇｙｚｙ－９用ＮＪ法聚类分析，构建了系统发育树（图２），表明菌株ｇｙｚｙ－９的ＩＴＳ序列与平革菌属遗传距离最近，证明内生真菌ｇｙｚｙ－９菌株属于平革菌属。
２．３ｇｙｚｙ－９抑菌活性分析
ｇｙｚｙ－９菌株的抑菌实验表明，其发酵液及其提取物对所选的试验菌株（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌）均有抑制作用，其中ｇｙｚｙ－９发酵液上清液对表皮葡萄球菌有明显的抑制作用，最大抑菌圈直径可达２０ ｍｍ，最小也达到１５ ｍｍ（图３ｃ），对枯草芽孢杆菌、腐生葡萄球菌及产气杆菌的抑菌活性中等（表１），但最大抑菌圈仍可分别达到１１ ｍｍ、１３ ｍｍ及１２ ｍｍ。提取物对枯草芽孢杆菌有显著的抑制效果，抑菌圈直径为１９ ｍｍ（图３ｅ）。通过上述试验可以看出发酵产物中含有抑菌物质，并有一定的抑菌效果。
３讨论
内生真菌在与植物长期协同进化中，其生物学特性为了适应内生环境可能发生了某些改变。在实验室条件下培养内生真菌，往往因离开了宿主植物，生物发育过程受到一定影响，而不能产生孢子或虽能产生孢子但孢子量极少，在实验室中采用传统的微生物分类方法进行菌种鉴定存在一定困难。该试验利用ＩＴＳ序列聚类分析，将此菌株初步鉴定为平革菌属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐ．）真菌。关于平革菌属，已有在环境有机物降解中发挥着重要作用的报道［８］。当在２９１ ｎｍ下用ＨＰＬＣ分析其发酵提取物时，发现ｇｙｚｙ－９在２．５３６ min的保留时间有明显吸收峰，与６０ μｇ／ｍＬ的高三尖杉酯碱标准品的保留时间２．５３２ ｍｉｎ基本一致，说明ｇｙｚｙ－９中有高三尖杉酯碱成分。通过进一步的抑菌试验证明此菌株的发酵液及提取物对试验菌株均有一定的抑菌效果，特别是对表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌效果较明显。这为下一步对此菌株产物的抗真菌、抗肿瘤的研究打下了一些基础，为利用植物内生真菌，寻找新的药用成分来源提供了参考。
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