硝基苯 [水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应]

中国科学 B 辑: 化学

《中国科学》杂志社2007年 第37卷 第2期: 197~206

SCIENCE IN CHINA PRESS

水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性

毒理学效应

周群芳 傅建捷 孟海珍 朱学艳 江桂斌*

①②②

张建斌 刘杰民 时国庆

①

①②

①②

①②

①

(① 环境化学与生态毒理学国家重点实验室, 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;

② 北京科技大学应用科学学院化学系, 北京 100083)

摘要 通过硝基苯对日本青鳉(Medaka, Oryzias latipes) 和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus) 两种小型实验鱼类的模拟暴露试验发现, 静水体系的硝基苯化合物含量在实验观测期间呈线性下降趋势. Medaka 和稀有鮈鲫可以剂量相关方式累积硝基苯, 回放清水时又可快速排出. 与Medaka 相比, 稀有鮈鲫表现出相对更为灵敏的中毒反应. 硝基苯可影响实验鱼肝脏抗氧化防御体系中超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)活性. 暴露实验鱼脑乙酰胆碱酯酶(AChE)活性变化揭示了硝基苯潜在的中枢毒性效应. 组织病理学研究证实硝基苯可对实验鱼靶器官产生组织损伤效应. 关键词 硝基苯 日本青鳉 稀有鮈鲫 生物富集 消除 分子生物标志物 组织病理学效应

1 引言

硝基苯俗称密斑油, 是化学工业中大量使用的化工原料和反应中间体, 广泛用于生产苯胺、农药、鞋油、止痛剂、染料和硝酸纤维素化合物. 由于硝基苯具有强烈的苦杏仁气味, 因而被认为是一种危险性空气污染物. 根据动物实验研究证明硝基苯具有致癌性, 因此它被划分为2B 组致癌物, 即人类可疑致癌物[1]. 在我国, 由于其高毒性效应, 国家环境保护局已将硝基苯定为环境中优先监测污染物之一. 然而, 由于生产管理等过程中存在的种种原因引起硝基苯意外泄漏事件屡有发生. 据估计每年释放到环境中的硝基苯约占其产量的0.06%~1.5%[2], 这导致周边环境受到严重污染, 因此研究硝基苯的毒理学效应, 特别是利用水生态毒理学方法可以很好地评价硝基苯污染对区域水生态系统的影响, 对正确

反映水环境硝基苯污染持久性及其对周围人体健康可能产生的潜在风险具有重要意义.

目前关于硝基苯类化合物对实验生物的毒理学效应研究报道比较多[3~5], 然而针对硝基苯对水生生物如鱼类、软体动物、浮游植物或浮游动物等的毒性报道大部分局限于其致死率的研究上[6~11], 探讨硝基苯在水生物体内的富集与消除. 对生物体正常生化过程的影响、以及其组织损伤效应的研究很有限[12,13], 而且所用暴露体系、实验动物或者终点指标各不相同, 因此利用以往毒性研究资料难以正确评价高浓度水体硝基苯污染事件对水生态系统可能产生的影响.

本研究通过硝基苯对两种实验鱼类: 日本青鳉(Medaka)和稀有鮈鲫水体模拟暴露试验, 以考察水中硝基苯的稳定性, 探讨短期暴露下实验鱼对硝基苯富集与消除状况. 研究了硝基苯对超氧化物歧化酶

收稿日期: 2006-09-04; 接受日期: 2006-12-31

国家自然科学基金(批准号: 40503014, 40590392), 中国科学院知识创新项目(批准号: KJCX2-SW-H06, KZCX2-YW-402)和北京市科技新星计划(批准号: 2004A51)资助项目

* 联系人, E-mail: gbjiang@rcees.ac.cn

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(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)在内的典型分子生物标志物活性影响, 并从细胞、亚细 胞结构水平分析了污染物暴露引起的鱼体组织病理学变化, 以此正确评价水体硝基苯污染对鱼类可能产生的亚急性毒理学影响.

久性状况.

基于急性毒性实验获得的两种鱼类的48 h LC50值, 设置空白对照组, 6.25, 12.5, 25, 50 mg/L, 研究亚急性暴露情况下, 两种小型实验鱼类在96 h内对水体硝基苯化合物的富集状况. 实验过程中, 每隔24 h换水1次, 换水量为暴露体积的一半. 定时采集水样以监测水中硝基苯维持水平. 暴露开始后, 每天观察实验鱼游动、觅食行为等生活状态. 暴露4天后, 取样, 鱼体用滤纸干燥后称重, −20℃冷冻保存, 测定其体内硝基苯浓度以研究实验鱼对水体不同浓度硝基苯的富集状况.

为了研究鱼体对水体硝基苯富集随时间的变化以及暴露鱼体回放清水后体内硝基苯的消除情况, 设置50 mg/L暴露组, 取稀有鮈鲫和Medaka 各34条, 暴露24 h, 而后投放到清水中24 h, 每隔一定时间取样. 每次各两条, 分别测体内硝基苯浓度.

设置空白对照组, 5, 20, 80 mg/L, 分别于暴露24 h 与48 h采样分析鱼体肝脏抗氧化防御体系典型分子生物标志物如SOD, CAT, 以及脑中枢神经毒性分子生物标志物乙酰胆碱酯酶活性变化, 从而筛选早期反映硝基苯暴露的生物标志物, 并探讨硝基苯对实验鱼短期暴露引起急性中毒反应的内在作用机制.

取50 mg/L暴露组在暴露7天后的鱼样, 冷休克后解剖取新鲜肝脏、鳃器官置于戊二醛或福尔马林液中固定, 以进行组织病理学观察.

2 实验部分

2.1 仪器

安捷伦6890气相色谱-5973N 质谱仪(Agilent Technologies, DE, USA)联用系统用于鱼体内硝基苯的分析.

固相微萃取装置购自Supelco Inc (Bellefonte, PA, USA), 萃取纤维为聚二甲基硅氧烷(polydimethy- lsioxane, PDMS, 100 µm), 用于样品的顶空萃取. TECAN 酶标仪(DNA Expert, Austria)用于SOD, AChE以及蛋白含量测定. 紫外-可见分光光度计(11-3010, 日本, Hitachi)用于CAT 测定. 奥林巴斯光学显微镜(BX41, Japan). Hitachi扫描电镜(S-3000N,日本). Hi-tachi 透射电镜(H-7500,日本).

2.2 试剂

硝基苯(分析纯, 北京化工厂), 称取1 g 硝基苯溶于1 L水中, 制成1 g/L标准浓溶液, 工作液由上述溶液依次稀释获得, 所有溶液均为现用现配.

SOD 分子生物标志物分析采用南京建成生物工程研究所生产的商品试剂盒.

2.5 实验方法

水样与鱼体中硝基苯测定方法参考文献[14]. 取10 mL水样于50 mL锥形瓶中, 在磁子搅拌下, 插入固相微萃取装置, 顶空萃取10 min, 萃取结束后, 将萃取纤维插入GC/MS气相色谱进样口进行热解析分析. 仪器进样口温度为250℃, 采用不分流进样. 色谱柱为DB-5 MS柱 (30 m × 0.25 mm, 0.25 µm). 载气为高纯氦(99.999%, 北京市华元气体化工有限公司). 采用恒流模式, 柱流速1 mL/min. 程序升温: 70℃, 保持3 min, 以10℃/min的速率升温至150℃, 保持2 min. 质谱离子源温度230℃, 四极杆温度150℃. 溶剂延迟设为3 min. 采用选择离子模式定量检测, 定

2.3 实验动物

实验动物采用实验室标准无病害环境下流水式养殖的稀有鮈鲫和Medaka. 实验水质参数如下: pH为7.4 ± 0.5; 溶解氧浓度为6 mg/L; 硬度为200 mg CaCO 3/L; 水温控制在25.0 ± 1℃范围内; 白天/黑夜循环时间是12 h/12 h; 暴露密度控制在1 g/L内. 实验采用换水式. 实验用鱼为3月龄成年雌性或雄性鱼,

Medaka 体重为0.21 ± 0.03 g, 体长3.02 ± 0.04 cm, 稀有鮈鲫体重为0.28 ± 0.05 g, 体长3.04 ± 0.02 cm.

2.4 实验设计

设置12.5 mg/L组为静水式暴露, 在整个暴露期

量离子为39, 51, 77, 93, 123. 匀浆后的鱼样置于50 mL 密闭锥形瓶中, 以上述方法进行萃取分析. 通过在20 µg/g的加标水平上进行加标回收实验, 发现水样与鱼样中硝基苯的加标回收率分别为85.8%和

间不换水, 在暴露期间以及鱼样采集完一定时间内取水样测定其中硝基苯浓度, 以有助于评价自然水体中由于硝基苯污染突发事件发生后其在水体中持

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82.3%, 这表明该分析方法可应用于本研究测定.

SOD 酶活性单位定义为每毫升反应液中, 每分钟抑制邻苯二酚自氧化速率达50%的酶蛋白量[15].

单位CAT 酶活性定义为25℃下, 100s内使过氧化氢分解1/2时的酶蛋白量.

乙酰胆碱酯酶活性单位定义为每分钟酶水解底物(ASCH)的量, 定量通过在412 nm处检测水解产物与DTNB 反应生成的黄色物质的吸光度值实现[16].

组织病理学观察用实验鱼靶器官或组织样品通过固定、脱水后, 进行石蜡包埋, H&E染色, 光学显微镜观察, 或者临界点干燥, 喷金处理, 扫描电镜观察, 或者树脂包埋, 超薄切片, 铅铀染色, 透射电镜观察.

图2 各暴露组水体硝基苯浓度变化

0.49, 11.22 ± 1.88, 24.95 ± 5.29, 48.90 ± 3.91 mg/L, 各组实际浓度值与各设定值偏差在7.8%~21%范围内, 这说明本研究中的较短时间内通过换水式暴露方式可以维持实验鱼相对稳定的暴露环境, 为了简便起见, 在后续研究中采用了硝基苯暴露的表观浓度来评价其对实验鱼的毒性效应.

2.6 统计分析

数据组间差异采用单因素方差分析(ANOVA), 检验水准为P

3 结果与讨论

3.1 水体硝基苯浓度监测

12.5 mg/L静水式暴露组水中硝基苯浓度监测结果见图1, 显然硝基苯在水体中的浓度呈线性下降(R 2>0.99), 5天(129.6 h)后水体浓度下降为起始浓度的一半, 9天(216 h)后水中硝基苯的消除率达77.8%, 这一结果与文献报道硝基苯在水中的半衰期结果相吻合[17]. 水体硝基苯化合物大部分可通过挥发作用扩散入空气[18~20], 因而其水中浓度可在较短时间内 降低.

6.25~50 mg/L暴露组水体硝基苯浓度监测结果如图2所示. 由图2可以发现在整个暴露期间水中硝基苯浓度变化不大, 各组浓度平均值分别为6.21

±

3.2 两种实验鱼对硝基苯急性毒性响应

在整个急性毒性测试过程中, 详细观察了高浓度暴露(50, 80, 110, 140, 170, 200 mg/L)下两种实验鱼的生活行为. 对照组所有实验鱼在整个实验过程中泳动、呼吸、觅食、对外界物理刺激(如轻敲缸壁) 等行为无明显变化. 在急性暴露实验中高浓度组(200 mg/L)稀有鮈鲫在实验开始0.5 h之内全部失去平衡, 并在1 h以后开始逐渐死亡, 至24 h全部死亡. Medaka 在暴露开始阶段对毒物响应灵敏度显著低于稀有鮈鲫, 暴露开始1 h内大部分鱼沉在缸底, 仅有两条出现身体平衡失调, 出现直立游泳等异常行为, 其它鱼在高浓度暴露后短期内的主要中毒症状表现为对外界物理刺激反应迟钝. 在其它较高浓度暴露组(如100 mg/L暴露组) 中, 两种实验鱼普遍出现浮于上层水面呼吸、活动的现象, 至暴露12 h稀有鮈鲫出现死亡现象, 而Medaka 死亡较晚出现. 在整个急性毒性暴露实验中, 在50 mg/L及以下暴露组两种鱼均没有出现死亡, 也无明显的活动行为改变. 通过上述观察, 可以表明稀有鮈鲫对高浓度污染物暴露在行为学响应上较Medaka 相对灵敏.

利用寇氏法(Karber法) 计算48 h半致死浓度, 获得硝基苯对Medaka 和稀有鮈鲫的48 h LC50分别为141.4 mg/L(95%置信区间: 137.0~145.8 mg/L)与133.0

mg/L(95%置信区间: 126.7~139.3 mg/L), 该数值与虹鳟(110.5 mg/L)[7], 黑头软口鲦(156 mg/L)[21]毒性响应

图1 静水体系中硝基苯浓度变化

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值相当. 另外, 根据实验获得的LC50值可以发现, 与Medaka 相比, 稀有鮈鲫对于硝基苯毒性暴露略为敏感.

3.3 硝基苯在鱼体内的生物富集与消除

对各暴露组实验鱼体内硝基苯含量分析结果如图3所示. 显然, 两种鱼类均能以剂量相关方式富集水体硝基苯化合物, 通过线性拟合, 发现在本实验浓度范围内实验鱼富集量与水体硝基苯含量可呈线性相关(Medaka: R 2 > 0.98, 稀有鮈鲫: R 2 > 0.99). 计算实验鱼对硝基苯的生物富集因子显示, Medaka与稀有鮈鲫的生物富集因子分布为3.9 ± 0.6, 2.8 ± 0.5. 由于硝基苯的lg K ow 为1.83

[22]

图4 实验鱼对硝基苯的富集与清除研究(n =2)

* 鱼体中浓度/µg ·g −1, 水体中浓度/mg·L −1

, H c (lg亨利常数) 为

−3.02[23], 因此其生物可给性比较低. 不同暴露水平下Medaka 体内硝基苯含量相对较高, 这可能与实验鱼种及鱼体内脂肪含量有关

.

Medaka 和稀有鮈鲫体内硝基苯基本上完全得到清除. 与对照组相比, 实验鱼活动行为得到有效恢复. 基于上述研究结果, 可以发现本研究所用实验鱼对硝基苯表现出了相似的富集与消除行为. 鱼体可以快速摄入水体硝基苯, 而在清水环境中又可快速清除体内硝基苯, 这说明硝基苯化合物在水生物中可能不具有生物累积效应.

3.4 硝基苯暴露对Medaka 和稀有鮈鲫典型分子生物标志物的影响

3.4.1 硝基苯对SOD 活性的影响

图3 不同暴露浓度下实验鱼体内硝基苯含量(n =10)

超氧化物歧化酶(SOD)作为抗氧化防御体系中的一个重要成分, 通过监测生物体肝脏SOD 活性可以很好评价受害机体氧化损伤状况. 硝基苯暴露下Medaka 和稀有鮈鲫肝脏SOD 活性变化比较如图5所示. 总体上, 不同浓度硝基苯暴露24或48 h可以引起两种鱼类肝脏SOD 活性抑制. 其中与稀有鮈鲫相比, Medaka肝脏SOD 活性呈较显著的暴露剂量相关式抑制效应(P

通过不同浓度暴露下两种鱼体内硝基苯含量分析还可以发现, 实验鱼个体间对硝基苯的富集量差别不大(图3), 因此在实验鱼对硝基苯富集与消除研究中, 在每个时间点上取两条鱼的平行测定值的平均值来反映其在设定暴露浓度与时间上体内的硝基苯浓度水平, 结果如图4所示. 显然当实验鱼投入50 mg/L硝基苯溶液中后, 可以在2 h内快速摄入硝基苯化合物, 并达到较高的富集水平. 在随后的22 h静水式富集实验中, 鱼体内浓度随着水体硝基苯浓度下降而呈下降变化, 没有出现污染物富集剂量的时间累积效应. 暴露状态下的两种实验鱼对外界刺激反应迟钝. 当实验鱼回放入清水后, 在1 h之内鱼体中大部分硝基苯得到排出(Medaka和稀有鮈鲫分别排出暴露24 h时的25%和20%). 当回放清水24 h时后

,

3.4.2 硝基苯对CAT 活性的影响

生物体内过氧化氢酶(CAT)作为一种有效的预警

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3.4.3 硝基苯对AChE 活性的影响

乙酰胆碱酯酶(AChE)活性作为神经毒性的分子生物标志物, 其活性变化可以用于解释硝基苯暴露鱼体行为学的变化. 硝基苯暴露24 h对Medaka 和稀有鮈鲫脑AChE 活性影响如图7所示. 结果表明硝基苯对Medaka 和稀有鮈鲫脑AChE 活性在短期暴露下(24 h)均表现出剂量相关的诱导作用(P

图5 硝基苯暴露引起SOD 活性变化(n =5)

M: Medaka, C: 稀有鮈鲫

酰胆碱, 从而中止神经冲动传输[24]. AChE活性变化可干扰胆碱能神经传输, 从而影响生物体运动和平衡, 及其正常的摄食、躲避和繁殖等行为[25]. 在本研究中, 硝基苯暴露引起两种鱼脑AChE 活性增强, 这可能是鱼体对损伤性刺激的响应. 动物可通过增强AChE 活性来补偿药物暴露对其产生的胁迫[26]. AChE活性增强表明神经递质胆碱水解增强, 由此引起烟碱和毒蕈碱受体活化下降, 正常的胆碱能神经传输受到影响, 因而促进实验动物产生中毒性行为学变化效应, 例如反应迟钝、游泳行为异常等. 另外, 稀有鮈鲫AChE 活性诱导效应相对更为明显, 这说明稀有鮈鲫脑AChE 对于硝基苯暴露表现出更为灵敏的响应变化. 该结果可很好解释急性暴露实验中高浓度硝基苯暴露组实验鱼不正常的活动行为. AChE活性的改变可能说明硝基苯对鱼类具有一定的神经毒性效应

.

性分子生物标志物在毒理学研究中得到广泛应用. 硝基苯暴露48 h对这两种鱼CAT 活性影响出现相反的现象, 即Medaka CAT活性总体呈现显著的诱导现象(P

.

图7 硝基苯暴露24 h对Medaka 和稀有鮈鲫脑AchE

活性的影响(n =5)

3.5 硝基苯暴露对实验鱼靶器官的组织病理学研究

根据实验室长期对Medaka 饲养观察发现,

图6 硝基苯暴露48 h对Medaka 和稀有鮈鲫肝脏CAT

活性的影响(n =5)

Medaka 体色可因喂养条件、营养状况、污染水质、健康条件等因素的变化而出现非特异的病理性体色发白的现象. 在本研究中, 对照组正常Medaka 体色

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呈浅橘红色, 而硝基苯暴露组Medaka 体色明显发白(如图8), 表明水中硝基苯化合物可能已经引起实验鱼机体出现病变.

在解剖过程中发现, 两种实验鱼均由于硝基苯暴露而出现胆囊充盈肿大, 胆汁颜色呈褐绿色的现象(如图9所示), 这种病变出现率高达100%. 与色泽红润质地均匀的正常肝脏相比, 暴露组肝脏色泽发乌, 有些出现溃烂糜散现象. 这些病理学症状的出现可能与鱼体肝胆的解毒功能相关. 实验鱼的肝胆病变可能影响了机体正常的消化代谢功能

.

到气体交换、渗透调节及其废物排泄等功能的正常运转, 从而危及鱼体的健康. 因此, 研究硝基苯对鱼鳃丝结构和功能的影响, 有助于了解硝基苯对水生生态系统的潜在危害.

通过光学显微镜观察可以发现, 与对照组相比, 暴露组鱼鳃出现呼吸上皮细胞及粘液细胞肿大增生、粘液增多, 有些鱼鳃上皮细胞发生坏死、崩解等组织损伤现象(如图10所示), 这些病变使得鳃的血－水交换屏障距离加大, 从而影响鱼体正常的呼吸, 导致鳃组织缺氧. 由于一般水体中上层含氧量相对较高, 因此中毒鱼群常出现上浮于水面的现象. 鳃器官功能损伤会引起鱼体衰弱, 最终死亡

.

图8 硝基苯暴露引起Medaka 体色发白

图10 硝基苯暴露引起鱼鳃病变(×400)

M: Medaka, C: 稀有鮈鲫

通过扫描电镜观察可以发现, 正常组鳃丝呈长条形. 鳃丝表面可分为非呼吸面和呼吸面. 非呼吸表面的上皮细胞表面布有微嵴与褶皱, 分布在靠鳃小

图9 50 mg/L硝基苯暴露7天引起实验鱼肝胆病变

M: Medaka, C: 稀有鮈鲫

片基部的较大的孔洞为氯细胞的开孔(图11). 呼吸面则集中在鳃小片表面, 呼吸面上皮细胞薄, 高度血管化, 具凹陷、高低不平. 鳃丝顶部具有规则或不规则的环形微嵴, 以及一些沟、坑、孔等凹穴结构(图12).

暴露组实验鱼鳃结构发生明显变化. 非呼吸面由于上皮肿胀而变得较为光滑, 微嵴断裂成碎片并散乱分布, 表面呈松散浮肿状. 呼吸面分泌颗粒物增多(图13). 鳃丝顶部规则的微嵴精细结构消失, 变成不规则皱褶状, 并有裂隙(图14). 硝基苯对实验鱼鳃组织结构的损伤可能会削弱鳃组织功能.

鱼鳃是个多功能的器官, 由鳃弓、鳃丝和鳃小片构成. 鳃丝和鳃小片表面覆盖扁平上皮组织, 含有扁平上皮细胞、泌氯细胞和粘液细胞, 其间分布着错综复杂的血管, 具有大表面积结构的鳃上皮组织有利于气体交换和离子交换的进行, 但同时也成为水体毒物首要的攻击目标. 鱼鳃一旦受到损害, 直接影响

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图11 正常Medaka 鳃丝非呼吸面与呼吸面结构 图12 正常Medaka 鳃丝顶部的微嵴结构 SL: 鳃小片, Nrs: 非呼吸面, Rs: 呼吸面, Op: 氯细胞的开孔 Mr: 环形微嵴, Mp: 凹穴, Cv: 沟壑

图13 暴露组Medaka 鳃丝呼吸面结构 图14 暴露组Medaka 鳃丝顶部结构

通过透射电镜观察可以发现鳃小片由单层或数层呼吸上皮组成, 上皮细胞表面有一层粘液. 包括扁平上皮细胞、柱状细胞等在内的各类细胞清晰可见, 泌氯细胞胞质中含有大量线粒体(图15(a)), 微血管中存在丰富的呈扁圆形血红细胞. 暴露组鳃组织中出现核膜肿胀、空泡状细胞(图15(b)), 或者凋亡小体(图

15(c)), 这些结果可很好验证了硝基苯对鱼鳃细胞的损伤效应.

肝脏是鱼体内最大的消化腺, 也是对有毒物质摄取、代谢与转化的重要场所, 是毒物攻击的主要目标, 因此它在毒理学研究中作为一个关键靶器官具有重要意义

.

图15

(a) 对照组Medaka 鳃组织泌氯细胞; (b)暴露组稀有鮈鲫鳃组织中空泡状细胞; (c) 暴露组Medaka 鳃组织中出现凋亡小体

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胞出现显著的肿胀变性现象, 核仁不清晰, 胞浆浊肿, 嗜酸性增强, 细胞间质增生, 细胞膜不明显, 出现灶状固缩, 以及细胞空泡变性, 肝窦消失(图16). 稀有鮈鲫肝细胞在光学显微镜下观察结果与Medaka 有所不同, 其暴露组与正常肝细胞相比, 胞浆空亮, 许多细胞核染色质着色很浅, 甚至消失, 出现核固缩, 肝窦扩张现象(图16). 硝基苯暴露引起两种鱼肝细胞形态发生不同的变化, 说明该化合物可能对不同鱼具有不同的作用机制, 这也与上面分析的两种暴露鱼肝脏内SOD 与CAT 活性变化不同的现象吻合.

扫描电镜观察结果显示对照组Medaka 肝细胞呈多边形, 相对比较扁平, 表面颗粒物或碎屑状物质较少, 细胞膜孔较小且少, 细胞间隙清晰可见(图17(a)).

图16 硝基苯暴露引起鱼肝实质细胞变化(×400)

M: Medaka, C: 稀有鮈鲫

而暴露组肝细胞肿胀圆润, 表面粗糙, 分泌颗粒物或碎片类组织较多, 细胞膜孔数目明显增多, 有些膜孔径较大, 细胞间隙消失. 这些现象可能说明硝基苯可引起鱼体肝细胞间质纤维化增生, 膜孔数目的增多可导致细胞内外物质交换失调, 从而引起细胞肿胀(图17(b)).

通过扫描电镜观察正常稀有鮈鲫肝细胞表面光滑, 细胞丰润饱满(图18(a)), 而暴露组稀有鮈鲫肝细

通过光学显微镜观察, 可以发现对照组Medaka 肝细胞成规则的多边形结构, 胞浆透亮, 细胞核与核仁清晰, 肝细胞间散在分布细小肝窦. 而暴露组肝细

图17 Medaka肝细胞形态

(a) 对照组; (b) 暴露组

图18 稀有鮈鲫肝细胞SEM

(a) 对照组; (b) 暴露组

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图19

(a)对照组稀有鮈鲫肝细胞中有丰富的粗面内质网和线粒体; (b) 暴露组Medaka 鱼体肝细胞中线粒体

肿胀并发生空泡状变性; (c) 暴露组稀有鮈鲫鱼体肝细胞中线粒体肿胀并发生空泡状变性

胞的主要病变表现为其表面颗粒物与纤维或碎片增多(图18(b)), 这与Medaka 肝病变症状相似.

根据透射电镜观察结果, 可以发现与对照组(图19(a))相比, 在暴露组鱼体肝细胞中出现了一系列的亚细胞结构形态病变. 其中核结构变化是细胞在衰亡和损伤过程中的重要表征之一. 在本研究中, 硝基苯暴露引起Medaka 肝细胞核变化主要表现为核染色质边集、核浓缩、核碎裂、核溶解以及异型性核等, 这些核结构改变大多是细胞不可复性损伤的标志, 提示活体内细胞死亡或坏死的出现. 线粒体是细胞内主要的能量形成所在, 也是极为敏感的细胞器, 所以在生理上或病理上都具有十分重要的意义. 图19(b)与(c)分别显示了两种鱼肝细胞线粒体转化为小空泡状结构, 表明线粒体已极度肿胀, 这与光学显微镜下观察到的胞浆浊肿的现象一致. 其肿胀可由多种损伤因子引起, 其中最常见的为缺氧, 各种毒物作用也可引起线粒体肿胀.

上述光镜与电镜观察结果显示, 水体中较高浓度的硝基苯化合物可以直接作用于实验鱼鳃、肝脏等靶器官, 并引起显著的病理学变化, 从而扰乱生物体正常的生理机能, 产生显著的中毒症状, 甚至导致死亡.

净, 因此该类鱼对外界污染物暴露相当敏感, 本研究结果很好地验证了这两类鱼对污染物耐受力的差别.

4 结论

硝基苯化合物可以在自然水体内通过挥发降解等方式得到较快清除. 高浓度硝基苯污染可引起Medaka 和稀有鮈鲫实验鱼出现急性中毒症状, 并导致死亡. 亚急性暴露下实验鱼体内硝基苯富集量与水体浓度相关. 实验鱼能快速有效富集水体硝基苯, 并在清水环境中快速清除体内硝基苯化合物. 硝基苯暴露可引起鱼体典型生物标志物如SOD, CAT和AChE 活性的抑制或诱导效应, 表明该化合物可通过多途径作用于实验鱼体. 组织病理学研究证实了硝基苯引起实验鱼鳃上皮细胞出现肿大增生、核膜肿胀、空泡状细胞, 或者产生凋亡小体等病理损伤现象, 对肝脏可产生如细胞肿胀、核结构改变、线粒体空泡状变性等组织损伤效应, 这些病理学变化可能是高浓度硝基苯引起实验鱼中毒甚至死亡的内在原因. 与Medaka 相比, 稀有鮈鲫对高浓度硝基苯暴露更为敏感.

参 考 文 献

1 US EPA. Proposed guidelines for carcinogen risk assessment.

Federal Register, 1996, 61(79): 17960—18011

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3.6 Medaka与稀有鮈鲫毒性响应比较

通过硝基苯暴露对Medaka 和稀有鮈鲫的行为学与典型分子生物标志物的比较分析可以发现, 稀有鮈鲫具有更为灵敏的毒理学响应, 这可能是由于Medaka 是源自日本水稻田、小河沟等地的一种小型实验鱼种, 那些区域污染相对严重, 因此该类鱼对外界污染物耐受力较强, 而稀有鮈鲫则源自我国四川境内山间清澈的小山沟中, 其原始生活环境比较纯

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中国科学 B 辑 化学

第37卷

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