[一株抗肿瘤活性的粗榧内生真菌的鉴定及其产物特性初步研究]真菌多糖与肿瘤

　　摘　要：利用传统分类学方法、电子显微镜观察、18S rDNA和ITS序列的测定以及系统发育分析对一株分离自粗榧抗肿瘤活性�生真菌HCCBl621进行分类鉴定，并对其产物抗肿瘤活性进行了初步研究，各种指标鉴定其为木霉属真菌绿色木霉(Trichoderma virlde Pers.ex Fr)，该菌株经发酵培养120h，抗瘤活性达最强；活性在pH4～9范围内稳定；60℃处理1h，活性稳定，这些特性为活性产物的分离纯化和稳定性研究提供了必要的参考。
　　关键词：粗榧；�生真菌；鉴定；抗瘤活性
　　中图分类号：Q93　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0233－05
　　
　　植物内生真菌是指生活在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌，它的涵盖面相当广，包括菌根真菌和植物病原菌以及存在于健康植物的茎叶中不形成明显病症的真菌，植物内生真菌在植物微生态系统中与宿主植物建立了和谐的协同进化关系，其次生代谢产物十分丰富，从中发掘为人类可利用的资源，意义重大。
　　1993年，美国蒙大拿州立大学的Strobcl小组在短叶红豆杉内生真菌(Taxomyces andreanae)中发现抗肿瘤药物紫杉醇以来，植物来源的内生真菌抗肿瘤药物重新被引起重视，人们陆续从多种植物内生真菌中分离到喜树碱等抗肿瘤活性物质，本研究在进行了大规模抗肿瘤活性菌株的筛选后，选取其中一株分离自粗榧根部并且表现出较强抗肿瘤活性的内生真菌进行了较系统的研究，现将部分结果报道如下。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　菌种来源
　　菌株HCCBl621由上海来益生物药物研究开发中心保藏。
　　
　　1．2培养基
　　固体培养基：DifcoTMPDA培养基和麦芽汁浸膏培养基。
　　液体培养基(％)：葡萄糖1.0，玉米粉1.0，黄豆粉2.0，KH2PO4 0.1，pH自然。
　　
　　1．3　菌株HCCBl621的分类鉴定
　　1．3．1　菌株的形态特征观察
　　根据《真菌鉴定手册》方法，采用平皿插片观察菌落形态，电子显微镜下观察菌丝体大小，形状、表面特征及是否有横隔、孢子大小、形状、类型、颜色等，对照确定菌株的种属地位。
　　1．3．2　基因组DNA提取、PCR扩增、序列测定
　　采用氯化苄法提取基因组DNA，根据真菌18S rDNA保守区设计引物，ITS(包括ITS1，5.8SrDNA，ITS2)序列用通用引物ITS4和ITS5扩增，引物由上海生物工程有限公司合成。
　　18S rDNA引物序列
　　Pf:5‘AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’, Pf:5‘-CGACGGGCGGTGTGTAC-3’;
　　ITS引物序列
　　ITS4: 5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
　　ITS5: 5‘-GGAAGTAAAAGTAACAAGG-3’.
　　反应体系：18S rDNA：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP2μL，Pf,Pr各2μL，25mmol/LMgCl2 2μL，DNA模板2μL，Taq聚合酶0.5μL，加ddH2O至50μL。
　　ITS：10×PCR buffrer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP　2μL，ITSl，1TS4各1μL，25mmol/L MgCl21.5μL，DNA模板2×L，Taq聚合酶0.2μL，加ddH2O至30μL。
　　PCR扩增条件：18S rDNA：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30S，72℃延伸80s，30个循环，最后72℃延伸10min。
　　ITS：94℃预变性1min，93℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
　　用Gel exraction Kit从胶中纯化回收PCR产物，测序工作由大连宝生物公司完成。
　　1．3．3　序列分析
　　将测序获得的18S rDNA和ITS序列通过与GenBank中核酸数据库序列进行Blast分析，利用Clustal x软件包构建系统发育树。进行亲缘关系和系统发育分析。
　　
　　1．4　供试细胞株及抗肿瘤活性检测方法
　　人肺癌腺细胞A549和大肠癌细胞LoVo，上海医药工业研究院药理室检测，具体步骤采用体外细胞毒测定的MTY法，用MK-2全自动酶标仪在570nm波长下测定OD值，按公式计算对肿瘤细胞生长的抑制率(IC％)。
　　IC％＝((对照组OD值－实验组OD值)/(对照组OD值))×100％
　　
　　1．5　菌株HCCBl621发酵代谢产物生物活性物质的稳定性试验
　　1．5．1　培养时间对菌株代谢产物活性的影响
　　将种子液接入发酵培养基，每隔24h取样一次，以跟踪肿瘤细胞抑制率，考察不同时间菌株代谢产物活性的变化。
　　1．5．2　不同pH对菌株代谢产物活性的影响
　　分别调节发酵上清液pH值为2、4、7、9、10、11以及正常发酵完pH7.4送样测活，考察活性物质对酸碱的耐受程度。
　　1．5．3　不同处理温度对菌株代谢产物活性的影响
　　分别于常温(25℃)、40℃、60℃、80℃、100℃处理发酵样品1h送样测活，考察不同温度对代谢产物活性�影响。
　　
　　2　结果与分析
　　
　　2．1　HCCBl621菌株的鉴定
　　采用形态观察的方法，HCCBl621菌株在PDA培养基28℃培养4d菌落直径达到90mm(图1)，菌落呈灰绿色粉状，菌落背面呈红棕色，营养菌丝透明光滑、有隔，0.6～1.4μm宽，孢子梗从气生菌丝中分生，2.5～6.5μm(图2A)，分生孢子梗呈二叉状或二叉状分枝，分枝角度多为锐角或近于直角，菌丛密集，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团，分生孢子不串生，球形，浅色或无色，2.1～3.4μm(图2B)，对照《真菌鉴定手册》将HCCBl621初步归属为木霉属(TrichodermaPers.ex Fr)。
　　
　　通过分子生物学方法，PCR获得菌株HC-CBl621的18S rDNA(GenBank登录号EF208957)和ITS(登录号EF212000)的近全长序列，分别为1567bp，581bp，将18S rDNA的序列与GenBank数据库中已经收录的序列进行Blast分析，结果表明，与HCCBl621菌株18S rDNA相似性较高的序列主要分布于木霉属，其中与之相似性最高的是绿色木霉(T.viride)和黄绿木霉(T. aureoviride)，相似性分别为99％和96％，由此初步判定HCCBl621为木霉属中的一个种，这与形态学的常规鉴定保持一致。
　　
　　为了进一步确认，选取GenBank中与HC-CBl621的ITS序列同源性高的系列菌株用于系统发育分析，其序列长为568～621bp，构建系统发育树，外群为Hypocrea G.J，S97-96(序列亦来自GenBank)，由图3可见，HCCBl621与绿色木霉(T.viride NR6938)组成一个单系类群(mono-phyletic group)，同源性达到99.2％，它们的亲缘关系最近， 同时它们又位于邻近的T.virideNR6940，6883，IMI，T2，CBSl64的小分支或平行支中，通过形态学特征观察、18S rDNA以及1TS序列进行聚类分析，初步确定其为木霉属真菌绿色木霉(T.viride Pers.ex Fr)，至于是否需要更进一步的细分如亚种或变种等，还需对更多的菌株进行序列分析，并结合形态特征、培养性状与生理生化特性等多方面的研究来确定。
　　
　　2．2 HCCBl621菌株发酵代谢产物活性的稳定性研究
　　
　　2．2．1　培养时间对菌株代谢产物活性的影响
　　结果见图4，在培养120h时取样对肿瘤细胞株A549抑制率达到最大，活性最高，稀释、1000倍后抑制率仍达将近60％，其抑制活性较其他时间差异显著，因此120h为最佳发酵终止时间，
　　2．2．2　不同pH对代谢产物活性稳定性的影响
　　由图5可以看出，发酵液在pH4～9之间活性保持稳定，其稳定性差异不显著，对A549细胞株的抑制率在稀释100倍后仍然可以达到60％以上，在pH低于4及大于9时活性稳定性明显下降，稀释1000倍后各pH条件下活性差异不是很明显，一方面可能是由于活性物质的量太少，接近其检出极限，也可能由于试验误差所致。
　　
　　2．2．3　不同处理温度对代谢产物活性稳定性的影响
　　发酵上清液在5种温度下处理1h(见图6)，60℃时稀释1000倍后对细胞株A549的抑制率仍在50％以上，活性保持稳定，同比80℃下活性下降4倍多，抑制率只为12.19％，这表明活性物质在60℃以下可保持稳定，这一特性为活性产物的分离提供了有益的参考。
　　　
　　3　讨论
　　
　　本研究通过对来源于中草药植物内生真菌的大规模分离，其发酵产物进行抗肿瘤模型筛选，得到多株抗肿瘤活性的功能菌株，比例约占总数的1.02％，其中分离自粗榧的菌株HCCBl621具有与粗榧所产生的三尖杉酯类生物碱相似的抗瘤活性，这一特性与人们提出的“协同进化”理论以及共生于中草药植物的内生真菌能产生与其相似的生理活性物质是一致的，深入研究开发有望实现大规模工业化发酵生产，从而为抗癌药物生产开辟新途径。
　　在传统的真菌分类学上，一直都是以形态学特征为主要鉴定标准，但在对相关属、复合种或亚种的鉴定分类时，利用真菌较保守的18S rDNA以及ITS序列进行系统发育聚类分析和真菌的多样性研究已经成为有效而快速的手段。
　　据报道，木霉属真菌绿色木霉是常见的土壤真菌，大多分离自土壤，它适应性强，生长迅速，传播蔓延快，分泌毒素破坏一些药用、食用菌菌丝的细胞质，抑制菌丝的生长，在农业上它对多种农作物病原菌如棉花立枯病具有拮抗作用，可用于农业上农作物的生防菌，绿色木霉(T.viridePers.ex Fr)共生于药用植物组织内部，并具有强烈抗人类肿瘤细胞的特性鲜见报道，本研究通过对菌株HCCBl621发酵代谢产物特性的初步探索，基本掌握了活性物质对温度、酸碱的耐受程度，这为下游生物活性物质的分离纯化工作提供了有益的参考，通过对代谢产物的分离纯化，已获得1个具有抗肿瘤活性的杂环类单体化合物，可见来源于不同生境的微生物能产生不同的生理活性物质，深入开发前景广阔。对于分离到的抗瘤活性单体化合物，具体的结构鉴定及抗瘤效果将另文报道。
　　
　　致谢：本文电镜照片由华东师范大学电镜组协助完成，在此表示感谢。
　　
　　作者简介：何玉华(1981－)，男，安徽宣城人，硕士研究生，主要从事微生物发酵工程研究；陈代杰(1957－)，男，上海市人，上海医药工业研究院研究员，博士生导师，通讯作者，主要从事微生物药物研究开发与微生物新药筛选的研发工作。