【人工神经网络在柚皮总黄酮提取中的应用】总黄酮的提取

　　摘要：为获得柚皮总黄酮提取的优化工艺，以乙醇体积分数、溶剂用量、提取温度和提取时间作为影响因素，进行了柚皮总黄酮提取的单因素试验和正交试验。以获得的２０个单因素试验结果和９个正交试验结果作为训练样本，设计和训练了４－５－１结构的三层ＢＰ人工神经网络。运用训练好的网络对设计的６２５种工艺组合进行预测，获得了３组总黄酮得率较高的提取工艺。结果表明，通过人工神经网络获得的提取工艺总黄酮得率比正交试验提高了５．７％。
　　关键词：人工神经网络；柚皮；总黄酮；提取
　　中图分类号：Ｓ６６６．３；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2088-04
　　
　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ （ＡＮＮ） ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
　　ｆｒｏｍ Ｐｏｍｅｌｏ Ｐｅｅｌ
　　
　　ＨＵＡＮＧ Ｈｕａ１，ＬＩ Ｗｅｉ-ｒａｎ２
　　（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅｚｈｏｕ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｚｈｏｕ ５４２８００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｅｚｈｏｕ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｚｈｏｕ ５４２８００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｐｏｍｅｌｏ ｐｅｅｌ； ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｓｏｌｖｅｎｔ ａｍｏｕｎｔ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ２０ ｓｉｎｇｌｅ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ９ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｔｒａｉｎ ａ ４－５－１ ｔｈｒｅｅ－ｌａｙｅｒｓ ＢＰ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ６２５ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ； ａｎｄ ３ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｒｉｎｇ ａｂｏｕｔ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｒａｆｔ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｆｒｏｍ ＡＮＮ ｃｏｕｌｄ ｏｂｔａｉｎ ５．４％ ｍｏｒｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ； pｏｍｅｌｏ ｐｅｅｌ； fｌａｖｏｎｏｉｄｓ； eｘｔｒａｃｔｉｏｎ
　　
　　人工神经网络（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ，ＡＮＮ）是一种模仿人类大脑思维的仿生算法，它既可模仿人的逻辑思维，又可模仿人的形象思维，是典型的非参数数据处理方法［１，２］。人工神经网络能通过学习自动掌握和挖掘隐藏在事物内部的、不能用明确数学表达式表示的“灰箱”或“黑箱”关系。典型的人工神经网络的结构见图１，信号由输入层输入网络，经过转移函数向前传播至隐含层，隐含层输出的信息再经过转移函数传播到输出层，最后给出输出结果。
　　由于人工神经网络非常适于处理非线性问题，在食品工业及其他行业获得了广泛的应用。在工艺建模及优化、过程控制及预测等方面均有成功应用的例子［３］。如廖孙启［４］在赖氨酸发酵动力学的基础上，结合模式识别和人工神经网络对发酵过程进行建模并寻找最优点，计算所得优化工艺参数用于实际生产可提高产率，缩短周期并提高生产效率。黄明志等［５］利用ＢＰ网络和ＲＢＦ网络对红霉素的发酵过程进行预估，经训练后的神经网络可在线预估出红霉素效价、葡萄糖浓度、ＮＨ２－Ｎ浓度、丙醇浓度和菌体浓度等。蒋益虹等［６］将人工神经网络与传统正交试验方法相结合，获得了红曲杨梅果酒发酵的最佳工艺并应用于实际生产中，取得了较好的效果。朱近等［７］在试验数据的基础上采用ＢＰ神经网络来建立全麦饮料配方试验的数学模型并用Ｃ语言模拟全面试验来选择配方。
　　正交试验法由于其直观、简单、有效，正在获得日益普遍的推广应用。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况。但因为试验成本和其他因素，正交试验的次数有限，其得到的试验结果只能说明大致情况，仍然具有一定局限性。
　　若将正交试验的结果用于训练人工神经网络，然后在此基础上对全部水平组合进行预测，则既能达到全面试验的效果，又不会增加试验成本。本研究将柚皮总黄酮提取的正交试验结果用于训练ＢＰ人工神经网络，然后用训练好的网络对设计的６２５种工艺组合进行预测，找到了更加合理的提取工艺。该方法具有快速、准确和低成本的特点，值得推广。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１柚皮普通柚皮，收集于广西贺州市农贸市场，洗净，切分，在６０℃干燥后粉碎，过４０目筛。保存备用。
　　１．１．２试剂芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；其他试剂均为分析纯。
　　１．１．３仪器ＦＷ８０微型高速万能试样粉碎机，河北省黄骅市新兴电器厂；ＬＡ２０４电子天平；常熟市百灵天平仪器有限公司；ＶＩＳ－７２３型可见分光光度计，上海第三分析仪器厂。
　　１．２方法
　　１．２．１柚皮总黄酮的提取工艺准确称取柚皮粉末５．００ ｇ置于提取罐中，加入一定量乙醇水溶液，在设定温度下浸提，每个样品提取两次，合并提取液。离心过滤得柚皮的乙醇提取液。试验方案如表１所示。先按照表１所设计的单因素试验方案，选出每个因素的最佳水平范围，然后据此设计４因素３水平正交试验。
　　１．２．２标准曲线制作精确称取经６０℃干燥至恒重的芦丁标准样品２０．０ ｍｇ，用６０％乙醇溶液溶解并定容至１００．００ ｍＬ，摇匀，得０．２００ ｍｇ／ｍＬ芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液０、１、２、４、６、８、１０ ｍＬ，分别置于２５ ｍＬ比色管中，分别加５％ＮａＮＯ２ １ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ后分别加１０％Ａｌ（ＮＯ３）３ １ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ，再分别加１％ＮａＯＨ １０ ｍＬ，摇匀，用６０％乙醇溶液定容至刻度，放置１５ ｍｉｎ后，以空白为对照，于５１０ ｎｍ波长处测定吸光度，以芦丁浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）对吸光度Ａ作标准曲线，得回归方程为：Ａ＝０．００９ ９Ｃ＋０．００１ ４，ｒ＝０．９９８ １。
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　　１．２．４人工神经网络设计人工神经网络设计应用ＭＡＴＬＡＢ６．５软件。采用三层ＢＰ神经网络，分别将４个试验因素作为人工神经网络的输入，总黄酮得率作为输出，因此神经网络的输入层定为４个神经元，输出层神经元为１个。第一层的转移函数是ｔａｎ－ｓｉｇｍｏｉｄ，输出层的转移函数是ｌｉｎｅａｒ。通过多次模拟试验，调整网络参数，以提高网络学习和预测能力。
　　２结果与分析
　　２．１单因素试验结果分析
　　单因素试验结果分别如图２、图３、图４和图５所示。从图２可以看出，在乙醇体积分数为６０％时柚皮总黄酮得率最高，继续增加乙醇体积分数反而使总黄酮得率下降。由图３可以看出，当使用２０倍数溶剂提取时比１０倍溶剂提取的总黄酮得率明显提高，继续增加溶剂用量则没有明显作用，说明使用２０倍左右的溶剂即能使绝大多数总黄酮浸出。图４表明，提取温度低于６０℃时温度的提高能增加柚皮总黄酮浸出。但温度高于６０℃后总黄酮得率反而下降。可能由于温度的升高加速了总黄酮损失。图５说明，提取的前２.0 ｈ，柚皮总黄酮的溶出速度较快，浸提２.0 ｈ后，溶出速度逐渐下降。溶质的浸出过程是一个传质过程，随着浸出时间延长，传质推动力降低，因此浸出速度下降。由图５可以看出，柚皮总黄酮的浸出时间为２.0 ｈ较合适。
　　２．２正交试验结果分析
　　根据单因素试验结果，设计４因素３水平正交试验。因素与水平设计见表２。正交试验结果如表３所示。表３显示，各因素对总黄酮得率影响的大小顺序为Ａ＞Ｂ＝Ｄ＞Ｃ，即乙醇体积分数＞溶剂用量＝提取时间＞提取温度。最优浸提工艺组合Ａ２Ｂ２Ｄ３Ｃ３，即乙醇体积分数为６０％，溶剂用量为２０ ｍＬ／ｇ，提取温度为６５℃，提取时间为２．５ ｈ。考虑到６５℃和６０℃的提取温度对柚皮总黄酮得率并无明显影响，因此选择提取温度为６０℃以节约能源。
　　以上述最佳工艺组合对柚皮总黄酮进行验证试验，结果总黄酮得率为１．８４％，高于正交试验出现组合中的最高得率。证明了正交试验的有效性。
　　２．３人工神经网络优化提取工艺
　　２．３．１网络参数优化以已经获得的２９组单因素试验和正交试验结果作为训练样本对网络参数进行优化，以内部交叉验证法检验网络训练效果。为使网络获得良好的收敛性，数据在输入之前全部进行归一化处理。以网络拟合残差为考察指标，通过改变网络参数进行拟合试验，优化网络参数。隐含层节点数、学习速率和学习次数对网络拟合残差的影响分别如图６、图７和图８所示。
　　图６说明，隐含层节点数对网络的预测能力具有较大影响。隐含层节点数过少，网络预测能力不足，会使拟合残差增加；而隐含层节点数过多，网络难于收敛，同样会增加拟合残差。经多次试验，隐含层节点数确定为５个。学习速率对网络的训练同样有重要影响。从图７可以看出，一开始，随着学习速率增加，拟合残差降低，而后随着学习速率增加，网络拟合残差急剧增加。因为过小的学习速率容易使网络陷入死角，无法达到学习目标。而过大的学习速率又使网络拟合残差增加，同时难于收敛。学习速率定为０．０５较合适。从图８可以看出，当学习次数超过２ ０００次时，拟合残差不再降低。超过２ ０００次以后的学习对网络的性能没有提高，属于无效学习。综合以上结果，确定网络隐含层节点数为５个（即网络结构为４－５－１型），学习速率为０．０５，学习次数为２ ０００次。
　　２．３．２网络预测经过对自己设计的６２５种工艺组合进行模拟和筛选，找到其中预测结果较高的３种组合，其提取工艺参数和预测结果（总黄酮得率）如表４所示。由表４可以看出，筛选的３种组合的实测结果均高于正交试验所得的最佳组合。综合节能和环保等方面考虑，最后决定采用第一种组合作为最后采用的提取工艺。即乙醇体积分数为５５％，溶剂用量为２０ ｍＬ／ｇ，提取温度为６２．５℃，提取时间为２.0 ｈ，柚皮总黄酮得率为１．９４５％，比正交试验最优组合提高５．７％。
　　３结论与讨论
　　以乙醇体积分数、溶剂用量、提取温度和提取时间为考虑因素，通过４因素３水平正交试验得到了柚皮总黄酮的优化提取工艺。在正交试验的基础上，通过设计和训练人工神经网络，对多种工艺组合进行预测，最后得到了柚皮总黄酮提取的最佳工艺组合，比正交试验得到的总黄酮得率提高５．７％。
　　正交试验是研究多因素多水平的一种设计方法，是做工艺优化时广泛采用的经典的方法。正交试验根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，是一种高效率、快速、经济的试验设计方法。然而，正交试验不能完全代替全面试验。以正交试验结果为基础，设计和训练人工神经网络，然后利用训练好的网络对所有可能的组合进行预测，就可以实现全面试验，从而得到最优的工艺条件，同时还可以节约大量时间和成本。该方法是一种全新的工艺优化模式。
　　
　　参考文献：
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　　［２］ 殷勇，田先亮，易军鹏，等．人工嗅觉技术在酒类鉴别中的应用现状与展望［Ｊ］．食品科学，２００３，２４（８）：２０４－２０６．
　　［３］ 李琳，赵谋明，张黎．人工神经网络在食品工业中的应用［Ｊ］．食品研究与开发，２００５，２６（１）：１３－１６．
　　［４］ 廖孙启．赖氨酸发酵工艺参数优化［Ｊ］．四川食品与发酵，２００１（２）：３６－４０．
　　［５］ 黄明志，杭海峰，储炬，等．人工神经网络在红霉素发酵过程状态预估中的应用［Ｊ］．华东理工大学学报，２０００，２６（２）：１６２－１６４， １７６．
　　［６］ 蒋益虹，冯雷．人工神经网络方法在红曲杨梅果酒发酵工艺优化中的应用［Ｊ］．农业工程学报，２００３，１９（２）：１４０－１４３．
　　［７］ 朱近，朱新星． Ｂ－Ｐ神经网络在全麦饮料配方设计中的应用［Ｊ］．食品科学，１９９６，１７（６）：３－７．
　　
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