【菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白工艺优化研究】菠萝蛋白酶的作用
摘 要：以水解度为指标，研究了温度、pH、底物浓度、酶浓度等因素对菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响。影响菠萝蛋白酶水解大豆蛋白的影响因素顺次为酶浓度、温度、底物浓度、pH。最佳参数组合是酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%、pH为8.0。在此条件下，菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度在半小时内可以达到8.18%。
关键词：菠萝蛋白酶 大豆分离蛋白 水解度
菠萝蛋白酶是以菠萝的果、茎、叶、皮等为原料，运用现代生物分离提纯技术制成，其外观为微黄色粉末状，分子量为33000，等电点为9.5。菠萝蛋白酶能够水解大豆分离蛋白制作大豆肽，该方法价廉，且易进行、易控制、易分离，安全性高，受到行业人士广泛关注。本试验通过研究菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的工艺条件，探究菠萝蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力和最佳的工艺参数，控制水解度，为行业应用提供科学依据。
1 实验材料与方法
1.1 主要实验材料与试剂
大豆分离蛋白 河南郑州同创益生食品有限公司
菠萝蛋白酶(2500GDU/g) 广西南宁杰沃生物制品有限公司
盐酸溶液(0.1141mol/L) 河南省洛阳市化学试剂厂
NaOH溶液(1.075mol/L) 河南省洛阳市化学试剂厂
1.2 主要仪器与设备
凯氏定氮仪（天津玻璃仪器厂）
90W电动搅拌器（金坛市金城教学仪器厂）
DELTA-320型pH计（梅特勒公司）
HH-4数显恒温水浴锅（国华电器公司）
碱式滴定管（天津玻璃仪器厂）
T-500型电子天平（上海精密仪器厂）
1.3 实验方法
1.3.1 蛋白含量测定
参照GB/T5009.5-2003[1]。
1.3.2 水分含量测定
参照GB5009.3-2003[2]。
1.3.3 大豆分离蛋白水解度测定方法
大豆分离蛋白水解度采用pH-State法[3,4]。在大豆分离蛋白水解过程中及时加入NaOH标准溶液维持pH不变，随预定的反应时间记录维持反应体系pH恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数，最后计算大豆分离蛋白水解度。
1.3.4 大豆分离蛋白水解方法
配制一定浓度 (W/V)的大豆分离蛋白溶液，加热至水解温度，用酸或碱调节溶液pH至预定值，按蛋白酶添加量称取蛋白酶加入大豆分离蛋白溶液中，在反应过程中及时加入NaOH溶液维持pH不变，随预定的反应时间记录维持反应体系pH恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数，最后计算大豆分离蛋白水解度。
2 实验结果与讨论
2.1 大豆分离蛋白成分分析
2.2 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳参数确定
2.2.1 温度对波萝蛋白酶水解的影响
在设定pH为7.5，底物浓度为4%，酶浓度为2.5%，时间为30min条件下，测定不同温度下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度，结果如图1所示。温度从45℃变化到70℃，大豆分离蛋白水解度随着温度的增大而增大，当温度为60℃时，水解度达到最大，60℃之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在60℃时最大，在60℃以下菠萝蛋白酶活性随温度增大而增加，超过60℃时，菠萝蛋白酶因温度过高而开始变性失活。
2.2.2 pH对波萝蛋白酶水解的影响
在设定温度为60℃，底物浓度为4%，酶浓度为2.5%，时间为30min条件下，测定不同pH下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度，试验结果如图2所示。pH从6.5变化到7.5时，大豆分离蛋白水解度随着pH的增大而增大，当pH为7.5时，水解度达到最大，pH7.5之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在pH7.5时最大，在pH7.5以下菠萝蛋白酶活性随pH增大而增加，pH超过7.5时，菠萝蛋白酶的活性因pH上升而下降。
2.2.3 底物浓度对波萝蛋白酶水解的影响
在设定温度为60℃，pH为7.5，酶浓度为2.5%，时间为30min条件下，测定菠萝蛋白酶在不同大豆分离蛋白底物浓度下的水解度，试验结果如图3所示。底物浓度从3%变化到4%时，大豆分离蛋白水解度随着底物浓度的增大而增大，当底物浓度为4%时，水解度达到最大，底物浓度超过4%时，大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶水解最佳底物浓度为4%。底物浓度过低，影响酶和底物结合几率，水解度下降，底物浓度过高会抑制大豆分离蛋白的水解。
2.2.4 酶浓度对波萝蛋白酶水解的影响
在设定温度为60℃，pH为7.5，底物浓度为4%，时间为30min条件下，测定不同酶浓度下菠萝蛋白酶水解的水解度，试验结果如图4所示。酶浓度从2.5%增加到6%时，大豆分离蛋白水解度随着酶浓度的增大而快速增加，当酶浓度达到6%时，大豆分离蛋白水解度开始增加缓慢。当菠萝蛋白酶的浓度超过5%时大豆分离蛋白水解度增加很小，这是因为当酶与底物完全作用时，过量的酶不会增加水解速率，因此菠萝蛋白酶水解时酶浓度为5%即可。
2.2.5 时间对波萝蛋白酶水解的影响
在设定温度为60℃，pH为7.5，底物浓度为4%，酶浓度为5%，测定不同时间下菠萝蛋白酶水解的水解度，试验结果如图5所示，菠萝蛋白酶水解反应时间从10min增加到30min时，大豆分离蛋白水解度随着反应时间的增加而增加较快，菠萝蛋白酶水解反应30min之后水解度增加缓慢。当反应时间超过30min时水解度增加很小，这是因为水解反应超过30min时，菠萝蛋白酶酶作用点数目所剩很少，因此考虑反应效率，菠萝蛋白酶水解时间为30min即可。
2.2.6 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白工艺条件优化
选用L9(34)正交表试验方案，以水解度最大值为评价指标，在水解时间为30min下，对温度、pH、底物浓度、酶浓度进行优化。菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白参数正交试验因素水平范围见表2，菠萝蛋白酶水解参数正交试验表见表3。用极差法分析正交试验数据结果可知，影响菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白参数的大小顺序(即R值大小顺序)为：酶浓度＞温度＞底物浓度＞pH；菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳参数组合为：酶浓度为6%，温度为65℃，底物浓度为5%，pH为8.0。在此条件下验证表明，菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度可以达到8.18%。
3 结论
菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳工艺条件为酶浓度为6%，温度为65℃，底物浓度为5%，pH为8.0，在此条件下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白30min，水解度为8.18%。
为了增加菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度，可延长反应时间，在此条件下水解4h，水解度可达11.07%。
参考文献
[1] 中华人民共和国国家标准.GB/T5009.5-2003 食品中蛋白质的测定方法[M]. 北京：中国标准出版社，2003.
[2] 中华人民共和国国家标准.GB5009.3-2003食品中水分的测定方法[M]. 北京：中国标准出版社，2003.
[3] Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. Elsevier Applied science Publishers, New York, 1986：74-78.
[4] Hevia P et al.Flavor of Enzyme-solubilized fish protein concentration fractions[J]. JAgr Food Chem, 1977, 25(4)：772.