【黑曲霉发酵生产壳聚糖的中试生产研究】壳聚糖与糖蜜发酵液

　　【摘要】本文对利用黑曲霉发酵法生产壳聚糖的中试实验进行了研究，确定了最佳工艺，为实现工业化生产奠定了基础。 　　【关键词】壳聚糖;黑曲霉;发酵工艺;提取 　　Study on Production of Chitosan by Fermentation of Aspergillus Niger in Medium Scale
　　WEIYan
　　（Lunan Hope Pharmaceutical Co., LtdShandongLinyi272600）
　　【Abstract】This article was researched on the middle-scale experiment to product chitosan by fermenting use aspergillus, determined the best technological parameter, which provide the foundation for the industrial production
　　【Key words】Chitosan;Aspergillus;Fermentation Process;Extraction
　　
　　甲壳素（Chitin）是自然界存在的唯一碱性同聚多糖，含量仅次于纤维素。甲壳素分链的强烈的包裹作用和结晶区内强烈的氢键使其化学反应活性很低，溶解性也差，因而大大限制了它的实际应用。壳聚糖（Chitosan）是甲壳素经脱乙酰化处理的产物，具有生物相容性、生物降解性、无毒性、几乎无过敏反应等特点，已在食品、化工、农业、医药、生化、环保等领域广泛应用，被喻为继糖、蛋白质、脂类、维生素、矿物质之后的第六生命要素[1] 。
　　目前利用黑曲霉发酵制备壳聚糖的研究非常活跃，也取得了很多成果。何灏 彦[2]等通过正交实验确定了最佳发酵培养基。黄惠莉[3]等采用机械破碎和酸碱交替结合，从菌体中提取甲壳素。曹健[4]等则采用电解法提取甲壳素。而在甲壳素转化为壳聚糖的研究中，多使用碱量法。黄惠莉[3]等采用高压稀碱法处理甲壳素，蔡中丽[5]等通过加入乙醇来降低碱浓度，郦和生[6]等则对利用微波技术提取壳聚糖进行了研究。
　　总之，利用黑曲霉发酵生产壳聚糖的研究非常活跃，也取得了很多成果。但要使发酵法实现工业化，还有很多问题需要解决。因此，在将实验室成果转化为工业技术前，必须先进行中试生产研究。
　　作者在组织中试生产的过程中，重点进行了工艺选择、生产条件优化等方面的研究，并形成了一套较为成熟的生产流程。
　　1.实验
　　1.1菌种、培养基、实验设备
　　菌种：黑曲霉(Aspergillus niger) 0代，由中国药品生物制品检定所提供，传至第三代使用。
　　根据文献资料，选择使用以下培养基。
　　斜面培养基：改良马丁琼脂培养基
　　扩大培养基[7]：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸出汁1%,PH6.0
　　发酵培养基：玉米浆3%、葡萄糖3%、硫酸镁1%、磷酸二氢铵0.01%、磷酸二氢钾0.005%
　　设备容量：2000L
　　生产环境：100000级洁净区
　　1.2实验方法
　　1.2.1壳聚糖产品的质量分析
　　脱乙酰度：采用酸碱滴定法测定游离氨含量，按下式计算壳聚糖脱乙酰度。
　　D.D�(C1V1-C2V2) ×0.016／G(100-W) ×0.0994
　　式中：C1-HCl标准溶液的浓度(mol/L)；C2-NaOH标准溶液的浓度(mol/L)；V1加入的HCl标准溶液的体积(mL)；V2 加入的NaOH标准溶液的体积(mL)；W为试样含水量(105℃烘干至恒重)；G为试样质量(g)；0.016为与1ml 1mol/L HCl溶液相当的胺量(g)；0.0994为甲壳胺中的理论胺含量(16/161)。
　　粘均分子量计算依据：根据Mark�Houwink经验公式[η]=Kma计算壳聚糖粘均分子量。a=0.71， K=8.93×10-4
　　壳聚糖产品得率=得到的壳聚糖重量／提取前的干菌体重量×100%
　　1.2.2壳聚糖的提取
　　根据文献资料，结合生产实际，作者设计了以下两种生产工艺同时投料生产，进行选择。
　　工艺（碱醇�微波法）一：
　　①菌株按10%接种量，通纯氧发酵32小时，离心分离得到菌体，洗涤干净，105℃烘干称重。
　　②50℃下，加入10倍体积7%NaOH溶液处理3小时，离心洗涤至上清液无色。
　　③微波480W功率下,加入10倍体积20%NaoH溶液处理20分钟，离心洗涤至上清液呈中性（第一次离心后的残留液回收蒸馏乙醇）。
　　④100℃下，加入15倍体积5%HCl溶液处理5小时，离心获得上清液，调节pH为8.0。
　　⑤离心洗涤沉淀，50℃下真空干燥得壳聚糖产品。
　　工艺（电解�高压稀碱法）二:
　　①菌株按10%接种量，通纯氧发酵32小时。离心分离得到菌体，洗涤干净，105℃烘干称重。
　　②加入12倍体积3%NaoH溶液，调节电压8V，电解1.25小时，离心洗涤至上清液呈中性。
　　③滤干水后，称取沉淀重量，按1：3固液比加入30%的NaoH溶液，表压689.5pa，121℃，反应2小时，所得固体洗涤至中性。
　　④离心，取沉淀物即为壳聚糖产品。
　　2.结果与讨论
　　2.1气源的选择
　　以空气作为气源发酵时，生物量和糖的变化如图1：
　　图1
　　以纯氧作为气源发酵时，生物量和糖的变化如图2：
　　图2
　　对比图1和图2可知，通纯氧能缩短生物量达到最大时的发酵时间，从而缩短生产周期，提高生产效率。
　　2.2提取壳聚糖的质量
　　工艺一：脱乙酰度为88.25%，粘均分子质量2.35×104，壳聚糖得率9.75%。工艺二：脱乙酰度为89.81%，粘均分子质量13.12×104，壳聚糖得率15.6%。
　　2.3产物鉴定
　　取工艺二提取的终产物进行红外光谱分析，根据表1描述，经鉴定为壳聚糖。
　　表1 甲壳素和壳聚糖典型样品主要谱带的位置及归属
　　3.结论
　　选择工艺二（电解�高压稀碱法）生产壳聚糖，壳聚糖的得率及质量均优于工艺一（碱醇�微波法）。并且工艺一用碱量约是工艺二的四倍，增加了成本及后期除碱难度。所以经过中试生产实验证明，电解�高压稀碱法是工业化生产中实际可行的提取方法。■
　　
　　【参考文献】
　　［１］代养勇.真菌几丁质和壳聚糖研究进展［J］.郑州工程学院学报.2004,25（3）:88-90.
　　［２］何灏彦.黑曲霉发酵生产壳聚糖的研究［J］.化学生物工程.2009,26（6）:86-87.
　　［３］黄惠莉.黑曲霉菌体制备壳聚糖［J］.化学研究与应用.2004,16（4）:575-579
　　［４］曹健.黑曲霉电解法制备甲壳素的研究［J］.工艺技术.2006,27（2）:186-192.
　　［５］蔡中丽等.化学世界.1998,（7）:352
　　［６］郦和生.利用微波技术从黑曲霉提取壳聚糖的研究［J］.石化技术.2001,8（4）:222-224.
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