整胚原位杂交_应用小鼠整体原位杂交技术检测ＭＤＭ２在鼠胚发育不同阶段的表达

　　摘　要：整体原位杂交(whole-mount in situ hybridization，WMH)已经成为基因表达定位和表达分布模式研究的一种重要手段。该技术能在整体水平上精确地研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息，而且为大规模筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段。采用体外转录地高辛标记的RNA探针，检测已知基因MDM2在鼠胚胎发育不同阶段的表达模式。
　　关键词：整体原位杂交：RNA探针；小鼠；MDM2
　　中图分类号：Q132．7
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02-0099-04
　　整体原位杂交作为检测胚胎发育过程中基因表达整体效果的快速、有效手段，已在基因表达的时空顺序和表达谱的建立等多方面得到了广泛的应用。整体原位杂交技术一方面为大规模的筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段。随着鼠胚胎早期发育阶段cDNA文库的完善，该技术可大规模的分离胚胎发育中重要的调节子，从而为胚胎形成模式提供了一个重要的新的分子遗传标志库。另一方面为检测某些细胞群在体内的原位转录本，并阐明分化过程中的分子遗传事件提供了帮助。如，鼠胚胎干细胞(ES细胞)为多能干细胞，其分化有助于了解胚胎的正常发育过程，而整体原位杂交技术能检测到其中某些少量的亚类细胞群在基因表达中的重要变化，而这些轻微的异质性是不能用总RNA的方法所能检测到的。此外，两个或多个基因在同一细胞内的共表达或两个基因在相邻细胞中的有序表达，为了解分子信号传导通路提供了一个可靠的切入点。
　　目前，整体原位杂交在海胆、两栖类等动物胚胎上已有初步尝试。本研究采用体外转录DIG标记的RNA探针，检测已知基因MDM2在鼠胚胎发育不同阶段的表达模式。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1　动物
　　小鼠胚胎来自怀孕的8～9d(E8-E9)的昆明白小鼠。
　　1．1．2　质粒
　　Pmdm2质粒DNA由法国PietteJ提供。质粒DNA含有T7和T3两种启动子，质粒全长为4495bp，包含1500bp Mdm2基因片段。
　　1．1．3　仪器设备
　　Orbital Mixer购自英国Denley公司；4℃低温冰柜购自美国法玛西亚公司；电热恒温水浴锅购自中国北京长安科学仪器厂；体视显微镜以及照相接口购自厦门Motic公司；照相机购自上海海鸥照相机厂。
　　1．1．4　试剂
　　体外转录试剂盒MEGAScriptTM购自Ambion公司；地高辛标记与检测试剂盒，BBR(BoehringerBlocking Reagent) 购自德国宝灵曼公司(BoehringerMannheim公司)；Formamide、CHAPS购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯．
　　1．2　方法
　　1．2．1 Pbmdm2质粒线性化
　　进行体外转录时要求线性化的模板DNA无核酸酶污染，因此在体外转录之前需对模板DNA进行酶切和纯化。具体方法如下：
　　
　　1)大量酶切反应
　　37℃水浴，酶切6～7h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况，酶切完全后终止反应。
　　2)酶切产物纯化回收
　　在酶切产物内加入7．5μL2g／L的蛋白酶K(终浓度为100mg／L)和7．5μL10％的SDS(终浓度为0．5％)，同时补充适量的超纯水至体系到达150μL。充分混合，50℃水浴处理30min。此后，加入75μL苯酚／75μL氯仿，充分混合后，室温放置5min，13000r／min于室温离心5min。取上清于一新的0．1％DEPC处理过的1．5 mL离心管中，加入1／10体积的5mol／L　NH40Ac(无RNase污染的)以及2倍体积无水乙醇(无RNase污染的)，－20℃放置1h，13000r／min，4℃离心15min沉淀DNA样品。75％酒精(无RNase污染的)洗一次。13000r／min，4℃离心10min。将DNA样品溶解于20μL0．1％DEPC处理的超纯水中。经1％琼脂糖凝胶电泳以及分光光度计测定DNA浓度，－20℃保存备用。
　　
　　1．2．2 探针制备
　　采用转录试剂盒进行，具体操作如下：
　　首先，制备纯化的无RNase污染的DNA模板，采用QIAGENPlasmidMinipurificationKit抽提质粒DNA，用相应的酶线性化模板DNA。蛋白酶K和SDS处理后，苯酚氯仿抽提纯化线性化模板DNA。
　　体外转录反应体系：
　　
　　37℃水浴孵育6h；加入1μL无RNase污染的DNase I，37℃水浴孵育15min；加入115μL无核酸的超纯水和15μL NH40Ac终止液，加入等体积酚／氯仿饱和液抽提一次，11000r／min，4℃离心10min；取上清，加入等体积氯仿再抽提一次，11000r／min，4℃离心10min；取上清于一个新的0．1％DEPC处理的1．5 mL离心管，加入3倍体积的无水乙醇和5mol／LNH4OAc，-20℃冰箱放置1h，11000r／min，4℃离心15min沉淀RNA，干燥后用无核酸酶的水溶解RNA。用1％琼脂糖凝胶电泳以及分光光度仪测定探针浓度，－70℃保存备用。
　　
　　1．2．3　小鼠胚胎的获取、固定和脱水处理
　　选用6―8周的昆明白鼠雌雄合笼，次日上午检查雌鼠是否有阴栓(plug)，将阴栓阳性雌鼠放于另一笼中喂养。在雌鼠怀孕后8-9d，经断颈术处死孕鼠，取出小鼠胚胎，在解剖显微镜下去除所有滋养外胚层、体壁层等外膜结构后，将胚胎置于15mL预冷的4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)中，4℃固定2h．以PBT(含0．1％吐温20的PBS)4℃洗3次，之后以100％甲醇洗3次，置－20℃备用。
　　
　　1．2．4　小鼠胚胎预处理和探针杂交
　　将固定和脱水处理后的胚胎以30％过氧化氢：甲醇按1：5的比例漂白，室温2h，甲醇漂洗3次，每次5min；然后依次通过75％、50％和25％的甲醇／PBT溶液各洗涤20min，PBT洗3次，每次20min；为使胚胎得到有效的漂洗，每5mL实验管胚胎数目为：E8～9=7～10个、E1O=2个。胚胎漂白后，再以10mg／L蛋白酶K／PBT37℃处理，处理时间为7～10min；PBS-Tween水平摇洗2次，每次5min，将胚胎在0．1％。戊二醛／4％PFA／PBT室温下再固定20min；在固定结束后，以PBT漂洗2-3次，每次5min(室温)；加1mL预杂交液(含50％甲酰胺、1．3×SSC(pH4．5)、50mg／L酵母RNA、10％Tween 20、10％CHAPS、 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 100mg／LHeparin)60℃水浴3次，每次1h；换含约1mg／LMDM2RNA探针的杂交液(成份同预杂交液)1mL；65℃杂交过夜。
　　
　　1．2．5 终止杂交，抗体孵育和显色
　　用预热的杂交液65℃漂洗30min；预热的溶液1(50％ frmamide／1XSSC／0．1％Tween 20新鲜配制)漂洗2次，每次1h；溶液1／MABT按1：1的比例(含100mmol/L maleic acid，150mmol/LNacl，0.1％ Tween20)室温漂洗30min；MABT漂洗4次，每次30min；MABT／2％BBR室温漂洗1h；2mL新鲜MABT／2％BBR／20％封闭用绵羊血清，室温孵育1h；MABT／2％BBR／20％封闭用绵羊血清／抗地高辛抗体，4℃孵育过夜，E7-9的抗体滴度为1／2000，E10为1／5000。
　　
　　1．2．6 终止显色，固定照相
　　依次以MABT(含100 mmol／L maleic acid，150mmol／LNaCl，0．1％Tween 20)漂洗10次，前4次15 min，后4次30min，最后二次1h，碱性磷酸酶溶液(100mmol／LTrispH 9．5，50mmol／LMgCl2，100 mmol／L NaCl，0．1％Tween 20，5mmol／L左旋咪唑)漂洗3次(室温)，每次10min；碱性磷酸酶溶液(100 mmol／LTris pH 9．5，50mmol／L MgCh，100 mmol／L NaCI，0．1％Tween20)室温洗2次，每分钟5次；碱性磷酸酶液中(含4．5 mL／LNBT，3．5 mL／LBCIP)避光反应，待显色反应至满意强度(室温孵育30 min-3 d)，换PBT液(PBT：0．1％(v／v)Tween 20／1XPBS pH7．8)室温洗6次，每分钟10次；体视镜下照相。
　　
　　2　结果
　　有研究表明，MDM2可在7．5 d鼠胚胎内含有神经脊始祖细胞的神经褶顶部和8d鼠胚胎内含有迁徙前神经脊细胞的神经褶背部检测到该基因表达。在此发育阶段，具有多潜能的神经脊细胞开始离开后脑神经褶区域，在腮弓处克隆生长，并形成多种类型的细胞或者组织，例如感觉神经元，神经胶质，黑素细胞，骨／软骨。本研究采用了DIG标记的MDM2 RNA片段作探针，体外转录标记长度为1．5 kb的反义链RNA，检测MDM2在鼠早期胚胎(E8-E9)中的表达情况(图1A、B、C)。杂交后经NBT／BCIP显色发现，在8～9d的小鼠胚胎中，在胚胎前脑(B，C)、中脑(A)、后脑部位(A，B)以及背侧脊索处均可检测到紫红色阳性信号(如箭头所示)，这与所报道的表达情况一致，说明该方法用于检测MDM2的表达分布是可行的。
　　
　　3　讨论
　　随着功能基因组时代的到来，有必要了解这些新基因的功能及在发育过程中的表达模式。而整体原位杂交技术正好为了解胚胎发育过程中的术相比，整体原位杂交有以下优点：1)能够直观地观察基因在整体中的时空表达分布，能很精确的反映基因表达的三维信息。2)可以同时分析多个组织块、胚胎或不同发育阶段的胚胎。
　　整体原位杂交技术最易出现的问题是高背景，低信号。为避免这一现象，在实验过程中我们需要注意以下几个方面：
　　
　　
　　3．1　蛋白酶K的处理时间
　　这一步是杂交成功与否的关键因素，蛋白酶K处理的目的是为了提高胚胎组织对探针的通透性，以便探针能够有效地进入组织细胞内与mR―NA靶分子进行杂交。如果处理不足，则会导致探针不能有效地渗透至组织内，不能显示杂交信号。整体原位杂交时，蛋白酶K处理的时间一般需要7-10min。其处理时间可根据胚胎的大小不同而定：E8～9＝8min、E10＝10min；在本实验中，我们主要通过眼睛检测蛋白酶K消化是否适度，当看见卵黄囊的碎片从胚胎体有脱落时，即可终止反应。延长蛋白酶K消化时间是为了更有利于探针的渗透，但是过之，则会导致低信号的发生，组织中的mRNA会因此弥散，被漂洗掉。可见，蛋白酶K消化处理是非常重要的一个步骤。
　　
　　3．2 探针及抗体浓度
　　探针和抗体浓度的高低对于杂交信号的强弱以及背景的高低都有很大的影响。探针及抗体浓度大，则可以得到较强的杂交信号，但背景色有可能较深，影响信号的观察。反之，在实验中，可通过降低探针和抗体浓度来减少高背景。降低探针浓度可减少非特异性的杂交，而降低抗体浓度可避免非特异的显色，避免高背景的现象。综合我们研究的经验，我们认为，在对交配后7～9d的小鼠胚胎进行整体原位杂交时，使用1、2 mg／L的探针浓度和1：2 000的抗体浓度是比较适度的。
　　
　　3．3 漂洗
　　无论是探针杂交后的漂洗还是抗体孵育后的漂洗，都可以有效的降低显色背景。因此，在探针杂交后和抗体孵育后都需要充分的漂洗。另外，可通过延长1h溶液1的漂洗以降低背景，同时在抗体漂洗后，将胚胎置于MABT4℃过夜，然后在显色前漂洗1h，2次，此步尤其适合E10的胚胎。另外，杂交后使用RNaseA充分降解未杂交的RNA探针也是降低背景信号的有效方法之一。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文