快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用:荧光PCR法快速检测B族链球菌

　　摘要：以牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）的保守基因序列为参考，设计、优化出一对特异的ＰＣＲ引物和一条ＴａｑＭａｎ荧光探针，建立一种快速定量检测牛病毒性腹泻病毒的实时荧光定量ＰＣＲ技术。该方法检测灵敏度比ＲＴ－ＰＣＲ高１００倍，并且避免了常规ＰＣＲ电泳检测所带来的高污染率。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，适用于牛场ＢＶＤＶ感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。
　　关键词：牛病毒性腹泻病毒；实时荧光定量ＰＣＲ；定量检测
　　中图分类号：Ｓ８５８．２３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1640-04
　　
　　Ｔｈｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Real-time Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｄｅｔｅｃｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ
　　
　　ＧＵＯ Ｒｕｉ１，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ２，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ１，ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ１，ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１， ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ１
　　（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ，Ｗｕｈａｎ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｕｂｅｉ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｗｕｈａｎ ４３００５０，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ） ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＶＤＶ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ． Ｉｔ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅ ｄｉｓｉｇｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｃｏｎｖｓｅｖｅｄ ｇｅｎｅ． Cｏｍｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ １００ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ than ＲＴ－ＰＣＲ ｔｅｓｔ； ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ usually caused by ｏｔｈｅｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｅ ＦＱ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒａｐｉｄ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ； ａｎｄ thus ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ for ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＶＤＶ ｆｒｏｍ ｃａｔｔｌｅ’ｓ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｅａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）； real-time ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　　
　　牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）引起的一种传染病，可引起许多临床症状和一些疾病，包括繁殖障碍、呼吸综合征、先天性缺陷、肠炎、持续感染（ＰＩ）和黏膜病（ＭＤ）等，易感动物除牛以外，还包括骆驼、绵羊、山羊、猪、鹿及多种野生反刍动物［１］。该病毒呈世界性分布，广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲许多养牛发达国家，是危害养牛业的重要病原之一。研究发现，其感染宿主涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄动物。每年死于ＢＶＤＶ感染的牛不少于５００万头，占饲养牛总数的０．５％～１．０％。ＢＶＤＶ感染怀孕母畜，造成胎儿产生免疫耐受，进而发展为持续性感染病畜，多数持续性感染动物外观健康，但生产性能下降，且成为重要的传染源。
　　ＢＶＤＶ和猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）同属黄病毒科瘟病毒属，基因组具有高度的同源性，能产生交叉免疫［２］。ＢＶＤＶ能感染猪，在全球广泛分布，对于无ＣＳＦＶ的国家（澳大利亚、爱尔兰、英国、丹麦），其猪群中ＢＶＤＶ抗体的阳性率在１．６％～４３．５％，而其他一些国家，阳性率更高。在我国，专家预测猪群中ＢＶＤＶ抗体的阳性率在５０％以上。ＢＶＤＶ在妊娠早期感染母猪，仔猪就会出现持续的ＢＶＤＶ感染，即胎儿通过胎盘感染，则仔猪形成免疫耐受，且持续性感染。仔猪形成的这种免疫耐受，可严重抑制ＣＳＦＶ活疫苗的免疫应答，导致猪群猪瘟野毒的感染，从而暴发猪瘟，对我国的养猪业造成了巨大的经济损失。
　　鉴于ＢＶＤＶ对我国养殖业（主要是养牛业和养猪业）造成的危害，建立一种准确、简便的ＢＶＤＶ病原检测方法，制定建议规程，对促进我国的养殖业健康发展、减少因该病引起的经济损失具有非常重要的意义［３，４］。实时荧光定量ＰＣＲ技术，是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［５］。该方法以其高灵敏度、高特异性、快速等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。本试验应用荧光定量ＰＣＲ技术对ＢＶＤＶ病原进行快速定量检测，不但灵敏度比普通ＰＣＲ高，而且还避免了普通ＰＣＲ高污染率的缺点，因此，开展该方法的研究，将具有良好的应用前景［６－１０］。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ株、牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）、ＤＨ５α感受态细胞为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验室保存；猪瘟兔化弱毒疫苗购自武汉中博生物制品公司；牛拭子样品采集湖北省出现疑似牛病毒性腹泻病的牛场；ＤＭＥＭ培养液、新生牛血清为ＧＩＢＣＯ公司产品；ＤＮＡ 凝胶纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自上海生工生物工程服务有限公司；ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。
　　１．2方法
　　1.2.1阳性模板DNA的制备
　　1）引物和探针序列。以ＢＶＤＶ的高度保守的５′端非编码区作为扩增靶区，设计并合成了一对引物和一条ＴａｑＭａｎ探针。具体序列如下：
　　上游引物（Ｂ１）：５′－ＧＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴ
　　ＡＧＴ－３′；
　　下游引物（Ｂ２）：５′－ＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣ
　　ＡＧ－３′；
　　探针序列（Ｂ）：５′－ＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡ
　　ＴＧＣＣＡＣＧ－３′；
　　探针修饰：５′－ＦＡＭ；（９）ＤＴ－ＢＨＱ；３′－ＰＯ４
　　 2）病毒培养。ＭＤＢＫ细胞经含１０％小牛血清和双抗（青霉素１００ μｇ／ｍＬ、链霉素１００ μｇ／ｍＬ）的ＤＭＥＭ培养液培养，待细胞长成７０％单层时，接种病毒液，３７℃吸附１ ｈ，其间不时摇动使液面均匀地铺在细胞上，然后加含２％小牛血清和双抗的ＤＭＥＭ维持液，３７℃继续培养，在细胞病变达８０％以上时收获。
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　　 4）标准阳性模板的构建。用上述引物进行常规ＰＣＲ反应扩增ＢＶＤＶ阳性模板ＤＮＡ，ＰＣＲ产物回收纯化后克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中，构建重组质粒，将重组质粒转化入ＤＨ５α感受态细胞内，进行白斑筛选，保存菌液，将菌液送上海生工生物工程服务有限公司进行测序。将测序结果与报道序列进行比对，从测序正确的菌液中大量提取质粒，质粒浓度用紫外分光光度计测定ＯＤ２６０nm值，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，－２０℃保存，使用前稀释。
　　１．2.2实时荧光定量ＰＣＲ该反应总体积２０ μＬ，反应体系为：１０倍系列稀释的标准品或待测样品的ＤＮＡ ２ μＬ，１０×Bｕｆｆｅｒ ２ μＬ，Ｂ１、Ｂ２各１ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），荧光探针Ｂ ２ μＬ（１ μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰｓ ０．５ μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５μＬ，去离子水加至２０ μＬ体系。反应条件为：９５℃ １０ ｍｉｎ；９４℃ １０ ｓ，４５℃ ３０ ｓ，４０个循环；72℃，１０ ｍｉｎ，检测荧光。
　　１．2.3ＢＶＤＶ实时荧光定量ＰＣＲ反应标准曲线的建立分别以经梯度浓度稀释的质粒为模板进行荧光定量ＰＣＲ扩增，并利用随机软件进行分析，得到动力学曲线及标准曲线。
　　１．2.4ＢＶＤＶ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的评价
　　1）敏感性。标准阳性模板经１０１～１０８倍梯度稀释，进行荧光定量ＰＣＲ检测，并与普通ＰＣＲ比较。
　　2）特异性。对标准阳性模板、猪瘟疫苗毒株、未接种病毒的ＭＤＢＫ细胞、去离子水进行荧光定量ＰＣＲ检测。试验结果经溶解曲线分析，验证其特异性。
　　3）重复性。取４份不同滴度水平的ＢＶＤＶ样品进行组间重复性荧光定量ＰＣＲ检测，反应重复２次，验证ＢＶＤＶ实时荧光定量ＰＣＲ的稳定性。
　　１．3临床样本检测
　　取湖北武汉、京山、仙桃、黄冈等地奶牛场疑似ＢＶＤＶ的病料，进行常规ＰＣＲ、RTQ－ＰＣＲ检测，以比较２种方法的灵敏度。
　　２结果与分析
　　２．１ＢＶＤＶ特异性片段的扩增结果
　　经２％琼脂糖凝胶电泳，ＰＣＲ产物大小约为２９３ ｂｐ，与预期结果相符（图１）。菌液送上海生工生物工程服务有限公司测序，与预期结果相符。
　　
　　２．２标准曲线及RTQ－ＰＣＲ灵敏度
　　以１０倍系列稀释的标准品（１０１～１０８拷贝／μＬ）为定量检测模板，在ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ定量仪上检测，得到动力学曲线图２和标准曲线图３。
　　在标准曲线的制作过程中，模板的起始数越低则Ｃｔ值越大（Ｃｔ值的定义是：每个管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数）。一般认为当Ｃｔ值在３５以上时，定量结果即被认为是不可靠的。图２显示，当标准质粒浓度≥１０拷贝／μＬ时，动力学曲线呈上升趋势，因此，该方法检测灵敏度为１０拷贝／μＬ（该检测灵敏度为被检样品的质粒模板浓度，如换算为被检样品浓度应该是２．３５×１０3拷贝／ｍＬ，为了统一起见，以下检测结果均为质粒浓度）。图３显示该方法定量检测的线性范围为１．０×１０-1～１．０×１０８拷贝／μＬ，相关系数r＝０．９９８ ０。
　　２．３特异性
　　如图４显示，对标准阳性模板有荧光显示；猪瘟疫苗毒株、对去离子水和未接病毒的ＭＤＢＫ细胞无明显荧光反应，表明RTQ－ＰＣＲ检测方法具有良好特异性。
　　２．４重复性
　　图５显示扩增结果曲线形态基本吻合，证明该检测体系具有很好的重复性。
　　
　　２．５RTQ－ＰＣＲ与常规ＰＣＲ比较
　　把阳性模板的细胞培养物用DEPC处理的水做１０倍梯度稀释，并进行RTQ－ＰＣＲ和常规ＰＣＲ检查，得到表１结果显示，RTQ－ＰＣＲ的检查灵敏度高出常规ＰＣＲ １００倍。
　　
　　２．６临床样品的检测
　　对２０１０年采自湖北武汉、京山、仙桃、黄冈等地奶牛场犊牛拭子样品，进行常规ＰＣＲ、RTQ－ＰＣＲ检测。结果显示在检测的６６份样品中，RTQ－ＰＣＲ检测阳性４２份，阳性检出率为６３．６％（４２／６６）；常规ＰＣＲ检测阳性２８份，阳性检出率为４２．４％（２８／６６），说明RTQ－ＰＣＲ比常规ＰＣＲ灵敏度高。
　　３讨论
　　本研究在比较ＣＳＦＶ有关序列的基础上设计了２对引物和中间标记的ＴａｑＭａｎ探针。经过引物筛选和反应条件的优化，建立了ＢＶＤＶ的快速定量检测方法，该方法检测灵敏度为１０３拷贝／μＬ，定量线性范围为１．０×１０３～１．０×１０８拷贝／μＬ，具有很好的重复性。试验结果显示该方法检测灵敏度比常规ＰＣＲ高１００倍。在临床样品的检测中，对疫苗毒株、犊牛拭子样品的检测结果显示该方法具有很好适应性。
　　总之，牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测方法特异性强、重复性好、操作简单快速，整个过程可在４ ｈ内完成［１１］。该方法具有其他方法无可比拟的优点，随着时间的推移，将可能成为检测牛病毒性腹泻病毒的最理想的标准。
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