基因在染色体上_MADS_box基因cDNA片段在甜菜染色体上的定位

第25卷 第5期

2008年10月

黑龙江大学自然科学学报J OURNAL OF NATURAL SC I ENCE OF H EIL ONGJI ANG UNI VERSIT Y Vol 125No 15October , 2008

MA DS -bo x 基因cDNA 片段在甜菜染色体上的定位

王玉婷, 高庆和, 马春泉, 王 冰, 汪立法, 曹洪祥,

111杜 萍, 张喜波, 李海英

(1. 黑龙江大学生命科学学院分子生物学重点实验室, 哈尔滨150080; 2. 黑龙江省肇东市农业技术推广

中心, 肇东151100) 121111

摘 要:以甜菜MA DS -box 基因c D NA 片段为探针, 采用Southern 杂交证实了其在甜菜基因

组中为低拷贝序列; 利用荧光原位杂交技术(FIS H ) 将其初步定位在二倍体栽培甜菜(Beta vulga r 2

is ) A2Y 的第2号染色体上。研究成功地实现了小片段低拷贝的功能基因在甜菜染色体上的定位,

为今后甜菜遗传物理图谱的构建提供了有效可行的方法。

关键词:MA DS -box 基因; 甜菜; 荧光原位杂交(FI S H ); 定位

中图分类号:S566. 3文献标志码:A 文章编号:1001-7011(2008) 05-0648-04

0 引 言

荧光原位杂交技术(F l u orescence In Situ H ypidization , FI S H ) 是基因物理定位中最直接、简便的方法之一, 它可以将基因直接定位到染色体的具体位置上。近20年来, 荧光原位杂交技术在植物中不断得到发展, 在植物基因组分析中得到广泛的应用

方面取得了令人瞩目的成就。

MA DS -box 基因是一类广泛存在于植物中的序列特异的同源异型基因, 它在植物发育尤其在花器官的发育中起着重要的调控作用

M eyero w itz 等[5][4][1-3]。目前, 该技术在染色体的鉴定、识别和重排以及基因图谱的构建。MADS 是由酵母细胞型特异基因的调节因子MC M1、酵母精氨酸代谢调节蛋白ARG80和拟南芥AC 蛋白、金鱼草DEFA 蛋白及人血清应答因子SRF 的基因首字母缩写而来, Coen 和研究表明:植物花发育分子机制的ABC 模型中大多数花发育相关基因属于MA DS -box 基因

[6]家族, 它主要的作用是:决定花分生组织的特性、调控花器官的特性

过程也起到重要的作用[7-8]、调控开花时间, 从而影响胚珠及果实的发育等等。近年来还有许多研究证实MA DS -box 基因对植物的细胞质雄性不育和育性恢复的核质互作。研究M A DS -box 基因功能及其作用的分子机制, 不仅有重要的生物学意义, 还可能将其应用于作物分子育种实践, 从而培育优良的作物品种。目前, 还没有关于MA DS -box 基因在植物染色体上被定位的相关报道。

本研究利用荧光原位杂交技术首次将MA DS -box 基因定位在甜菜染色体上, 旨为进一步研究MA DS -bo x 基因提供遗传学依据以及为甜菜遗传物理图谱的构建奠定基础。

1 材料和方法

111 实验材料

供试材料:黑龙江大学植物分子实验室所种植的二倍体栽培甜菜(Beta vulga ris ) A2Y 。

112 甜菜中期染色体的制备

参照陈瑞阳等[9]的方法稍加改进。待甜菜根尖长出1~2c m 时, 取生长旺盛的根尖, 在饱和对二氯苯溶收稿日期:2007-10-09

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871566); 黑龙江省自然科学基金资助项目(C2007-37); 黑龙江大学青年基金资助项目

作者简介:王玉婷(1984-), 女, 硕士研究生, 主要研究方向:植物分子生物学(, , , a :l

第5期王玉婷等:MA DS -box 基因c DNA 片段在甜菜染色体上的定位

[10]#649#液中于16e 处理115~2h 即可, 时间过长会出现染色体粘连和聚缩等毒害现象。将预处理过的根尖用

新鲜固定液(乙醇B 冰乙酸=3B 1) 4e 过夜固定后, 用双蒸水充分洗净根尖, 2%的果胶酶和纤维素酶1B 1混合液37e 下酶解70m i n , 水洗低渗后采用火焰干燥法制片。制好的片子在相差显微镜下镜检, 选择分裂相多, 染色体形态清晰且背景干净的片子, -20e 储存备用。

113 探针制备、标记与纯化

11311 探针的制备

本实验室前期根据甜菜MA DS -box 基因的表达序列标签(Me-341) 设计引物, 采用cD NA 末端快速扩增技术已经从甜菜花期表达基因中扩增出了MA DS -box 基因的全长c D NA 序列。

以甜菜总RN A 的反转录产物为模板, 根据所获得的M A DS -box 基因的c DN A 全长序列设计引物, 进行PC R 扩增。引物序列为:F356:5c C ACCC AAAAT TCAG A AACCT3c , R1390:5c GTT TA GGT TG C ATCT ACTGT CA3c 。将扩增出的长约1kb 的片段, 分别标记作为Southern 杂交和F I S H 的探针。

11312 FIS H 探针的标记与纯化

采用切口平移法对探针进行标记, 标记体系与反应时间如下:1L L d NTP 混合液(d ATP , dCTP , dGTP), 2L L D i g -d UTP , 2L L 标记缓冲液, 117L L D N a se Ñ, 113L L DNA 聚合酶, 1L g 模板cD NA , 加ddH 2O 至终体积20L L , 混匀后15e 反应115h , 2L L 015mol #L

凝胶柱离心纯化, 点印记检测标记效果。

114 Souther n 杂交

采用CTAB 法提取甜菜的总DN A 。总DNA 分别用Ta q I 、X s p I 和H a e III 进行酶切后电泳, 然后转移至H ybond N 尼龙膜上。杂交、洗膜等实验步骤均按照5分子克隆实验指南6的操作方法进行。

115 荧光原位杂交(FI S H )

-将制好的甜菜中期染色体片子60e 烘烤1h , RNA 酶(011mg #mL

20e 的70%、95%和100%梯度酒精中脱水(各5m i n ), 室温下晾干。

配置杂交液:用已标记的MA DS -box 基因c DNA 片段作探针, 配成杂交液(杂交液30L L /片:15L L 去离子甲酰胺, 3L L 20@SS C , 3L L 鲑鱼精D NA , 3L L 探针, 6L L 50%硫酸葡聚糖), 杂交液75e 变性5m i n , 冰上冷却至少5m in , 然后37e 杂交48h 。

荧光检出程序:¹杂交后的片子去掉盖玻片后依次在室温下2@SS C 漂洗10m in , 37e 下2@SS C 处理10m i n , 室温下2@SS C 和1@PBS 各漂洗5m i n 。之后每张片子加50L L 羊抗地高辛-荧光素偶联物(sheep anti-DI G-Fluoresce i n ), 37e 于保湿皿中温育1h 后, 室温下1@PBS 溶液振荡漂洗3次, 每次5m in 。º每张制片加50L L 兔抗羊I gG 荧光抗体(rabbit anti-sheep I g-DI G), 37e 于保湿皿中温育1h 后, 室温下1@PBS 溶液振荡漂洗3次, 每次5m in 。»片子在室温下晾干, 每张制片加30L L 10L g #mL 含有25%抗猝灭剂的D API 复染。用O l y mpus B X60荧光显微镜观察荧光原位杂交信号; 利用CCD 1401E 系统获取图像; 使用Photoshop

软件进行图片处理。-11+-1EDT A -N a 2终止液终止反应。Sephar ose CL-6B(Sig ma) 37e 处理30m i n , 70%甲酰胺(50mL 70%甲酰胺:35mL 甲酰胺、5mL 20@SSC 、10mL ddH 2O ) 70e 变性215m in 。然后, 将片子依次放入-

2 结果与分析

211 探针PCR 产物

待标记探针的PCR 产物电泳结果如图1。PCR 扩增产生

一条1000bp 左右的MA DS -box 基因c DN A 条带, 回收片段经

电泳检测, 浓度适于作FIS H 探针。

212 Sou th ern 杂交

采用地高辛D NA 标记检测试剂盒, 以随机引物法标记的

MA DS -box 基因c D NA 片段为探针, 与甜菜的总D NA Southern

杂交结果如图2所示。从图中可以看出, 3种限制性内切酶酶

切产物均为2~4条杂交带, 表明该基因在甜菜基因组中是以低

拷贝的形式存在的。

#650#黑 龙 江 大 学 自 然 科 学 学 报 第25卷 213 F IS H 结果

FI S H 定位结果见图3。信号点显示为绿色, 而染色体经DAPI 复染成蓝色。荧光原位杂交的结果表明, MA DS -box 基因定位于甜菜2号染色体的近末端, 如图3(A , B) 所示。试验结果既证明了小片段低拷贝基因可以成功的定位于甜菜染色体上, 为今后甜菜遗传物理图谱的构建奠定了基础。同时本文对MA DS -box 基因在甜菜染色体上的FIS H 结果进行了分析, 见表1。如表所示, 观察的88个中期分裂相中, 有6个具有杂交信号, 杂交信号检出比例为618%, 检出率较低。可能有以下两方面的原因:一方面, 植物存在细胞壁, 给染色体制片工作带来了很大的困难, 而细胞碎片的覆盖程度, 染色体形态的好坏都直接影响到信号的检出; 第二, 原位杂交的检出率与探针大小及拷贝数直接相关, 探针越小, 拷贝数越低, 检出率就越低。试验中, 使用的MA DS -box 基因的c DN A 探针片段较小, 仅为1kb, 并且Souther n 杂交结果表明MA DS -box 基因仅有2~4个拷贝, 属于低拷贝基因, 这些原因都直接影响了信号的检出率。此外, 所检出信号的分裂相都只在1条染色体上显示出杂交信号单点(图3中的A 和B), 与Souther n 杂交结果不完全相符, 但这同许多曾经报道过的低拷贝的FI S H 结果类似, 杂交信号在一条染色单体上相对容易检出。产生这种结果的原因可能是:其一, 植物细胞中存在有一些遗留的细胞壁碎片影响了探针的渗入, 并且小片段序列产生的信号太弱, 容易猝灭; 其二, 杂交信号受到染色体内部空间构型动态变化的干扰, 而常出现部分阴性杂交信号现象(即同源染色体之一无信号或姐妹染色单体之一无信号) [11]。基于上述原因, 本研究仅在2号染色体上检出单点。

表1 M ADS -box 基因荧光原位杂交检出结果

Tab le 1 T he r esu lts ana lysis of M ADS -box gen e d etec ted by F ISH

探针

Prob e

MA DS -bo x

基因c DNA 染色体号N o . of ch ro m oso m e 2号检测的染色体数(条) Number of ch ro m oso m es detect ed 88检出信号的分裂相数Num ber of s i gnals d etected 6检出率(%) Det ecti on rate(%) 618%

3 讨 论

为了获得较多的分散良好、形态清晰的中期染色体分裂相, 本文对材料的预处理和去壁低渗制片过程中一些影响制片质量的相关因子进行了摸索试验。植物细胞与动物细胞不同, 由于其有一层细胞壁的关系, 用一般的方法很难将其壁破坏掉。植物中常用的中期染色体制片方法主要有两种, 一种为压片法, 一种为酶解去壁法, 两种方法尝试结果表明:酶解去壁法由于片子在火焰上干燥, 并且固定液的蒸发使载玻片上的细胞质和细胞壁的碎片除去得较为干净, 从而使得背景较干净。这种方法与压片法相比, 同一分裂相的染色体比较集中, 染色体丢失少, 比较适合做荧光原位杂交试验。, -

明:对于甜菜生长旺盛的根尖, 4e 冰水浴处理24h 和16e 下饱和对二氯苯处理115~2h 均能获得较多的分裂相, 而饱和A -溴萘对于甜菜根尖有毒害作用, 不适于甜菜根尖的预处理。但是冰水浴处理的染色体浓缩程度高, 形态不易分辨, 饱和对二氯苯能够获得较多分裂相, 且染色体形态较好。

能够准确定位低拷贝小片段D NA 是广泛应用原位杂交技术进行植物基因组作图最重要的一步。近年来, 已有越来越多的功能基因被定位。但是由于低拷贝序列有难以杂交和不易检测的困难, 目前有关植物低

[12-16]拷贝基因定位的报道不是很多。尽管在植物中进行低拷贝基因的定位比较困难, 但近年来已有越来越

多的低拷贝基因用荧光原位杂交的方法进行了成功的定位[17-18]。本研究首次尝试了小片段的低拷贝基因在甜菜染色体上的定位, 取得了初步的结果, 但检出率较低, 仅为618%, 而且所检出信号的分裂相都只在1条染色体上显示出杂交信号单点, 这是因为小片段、低拷贝的序列有着难杂交和信号易猝灭的特点。针对与这些问题也采取了一系列的措施:适当的延长杂交时间, 使探针能够与染色体上的D NA 充分杂交, 使用合适的抗猝灭剂和高灵敏度的CCD 照相装置, 适当延长曝光时间来使信号增强, 因此本文成功地将MA DS -box 基因定位于甜菜中期染色体上。

目前, 对于低拷贝小片段的功能基因在甜菜上的FI S H 还处在初级的探索阶段。本研究首次尝试了低拷贝小片段的功能基因在甜菜染色体上定位, 取得了初步结果, 虽然没有精确确定出该基因的拷贝数, 但可以证明小片段的低拷贝基因可以成功的定位在甜菜染色体上, 同时摸索出了适宜甜菜荧光原位杂交的技术体系, 为下一步甜菜遗传图谱的构建奠定了基础。

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A pr im ary observa tion on the flo wer bud d ifferen ti a tion of Genti ana scapa Bunge

Sun Yan , W ang Gu i q iang , Fan Ji n g

Far E astern Nati onalUn ivers i ty , V l ad i vostok 690950, Ru ssia) 1, 211(1. College ofResources and En vi ronm ental Sciences , H eilongjiang Un i versity , H arb i n 150080, Ch i na ; 2. A cade m y ofMari ne Bi ology and Bi otechology ,

Abstr act :The process of flo wer bud dif ferentiation f or Ge ntiana sc a pa Bunge was observed i n deta il i n th is study . Si x stageswere recogn iz ed based on the morphol o gica l changes during t h e fl o wer bud d iff erentiati o n :the und iff eren 2tiated stage , pred iff erentiati o n stage , sepal pri m ordia d iff eren tiation stage , peta lpri m ordia dif ferentiation stage , sta 2men pri m ord i a d iff eren tiation stage and the p istal pri m ordi u m d iff eren tiation stage . The process of fl o wer bud d iff er 2entiati o n covered a period of about 50days (fro m the second decade ofM ay to the beginning of July). The i n itia 2ti o n of flo wer bud diff erentiation occurred at the ti m e when the p l a nt had 8~9ste m nodes , and plant he i g h t sho wed no relati o nship w it h the beginning ti m e of flo wer bud d iff erentiati o n .

K ey w ord s :Gentiana scapa ; flo wer buds ; morphologica l d iff erenti a ti o n

(上接第651页)

Chro m oso m a l loca liza ti on of MADS -box gene cDNA i n suga r beet

W ang Yuting , G ao Q inghe , M a Chunquan , W ang Bi n g , W ang Lif a , CaoH ongxiang ,

111Du Ping , Zhang X ibo , LiH a iying

(1. M olecu l ar Biol ogy Key Laboratory , College of L ife Sci ence , H eil ongjiang Un ivers i ty , H arb i n 150080, Ch i na ; 2. Agri cu ltural T echnol ogy Cen t er of Zhaodong Cit y , Zhaodong 151100, Ch i na) 121111

Abstr act :The c D NA of MA DS -box gene as the pr obe was used to study the properti e s , and the results of Souther n analysi s i n dica ted that it had lo w copies in the geno me of sugar bee t and t h e gene was located on diploi d Beta vul 2garis A2Y chro moso me N o . 2by the method of fl u orescence i n situ hypi d iz ati o n (FI S H ). The loca lizati o n of lo w copy gene on the chr o moso me of sugar beetwas firstly ach ieved successf u ll y . Itm ay provide eff ective method f or the constructi o n of physica lmap in sugar bee. t

K ey w ord s :MA DS -box gene ; sugar bee; t fluorescence i n situ hypidization (FI S H ); l o calization