黑芥子酶 拟南芥芥子酶基因ＴＧＧ６是花特异表达的假基因

　　摘 要：芥子酶是一类催化硫代葡萄糖苷水解的同工酶，TGG6是在拟南芥中新发现的芥子酶基因，从拟南芥几个不同生态型中克隆了TGG6基因的全长核基因和cDNA片段，序列分析结果表明，所有供试的生态型的TGG6基因都与拟南芥第3个芥子酶基因TcC3类似，在编码区存在1个以上移码突变，不能编码完整多肽。生态型Col-O第10个�含子的剪切边界还发生了缺失，导致内含子不能被切除，初步确定TGG6是一个假基因，然而，RT-PCR结果却表明TGG6在花器中特异性表达，说明TGG6在进化的某个阶段可能是有功能的基因，由于某种原因，该基因在进化过程中被失活。
　　关键词：拟南芥：芥子酶；TGG6；组织特异表达；花特异表达；假基因
　　中图分类号：Q78　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0316-07
　　
　　随着更多物种基因组测序计划的展开或完成，人们对假基因的概念及其意义有了更新的思考，并成为基因组学研究的一个热点，假基因(pseUdogene)被定义为核苷酸序列与相应正常功能基因相似的，但不能合成功能蛋白质的失活基因，假基因最初由jacq等人提出。他们在非洲爪蟾DNA中克隆了一个5S rRNA相关基因，在与其相应功能基因比较后发现，这个基因的5′端有16bp的缺失以及14bp的错配，不具有正常5S rRNA的功能，因此，将这个截短的5SrRNA的相关基因描述为假基因，随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施，对占人类基因组约90％的非编码序列的研究已经展开，预计人类基因组中有约20000种假基因，在线虫、果蝇以及酵母等生物中也发现大量假基因，假基因保留了祖先功能基因的残余拷贝，为研究生物进化和基因组动态变化，分析基因复制与突变等事件的年代以及频率，揭示基因组DNA替换、插入和缺失等事件的机制提供了重要线索，此外测定假基因的分布可为新基因的预测以及鉴定提供更好的帮助。
　　芥子酶(myrosinase，EC3.2.1.147)是一类硫代葡糖苷酶，主要分布在白花菜目植物中，专一降解硫代葡糖苷，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，当植物受到昆虫或病源伤害时，芥子酶将硫代葡萄糖苷水解为异硫氰化合物、硫氰化合物、腈或(口恶)唑烷硫酮等有毒物质，抵御病虫侵袭，因此认为“芥子酶／硫代葡萄糖苷”系统是植物重要的防御系统，目前已在15个科500多种双子叶植物中检测到芥子酶活性，其中，对十字花科作物的芥子酶研究得较多，油菜和白芥等作物的芥子酶基因家族由MA、MB、MC 3个亚家族组成，共20多个基因，其中部分基因已被证实为假基因”。
　　在拟南芥中，最初认为只有3个芥子酶基因，其中第3个基因TGG3被证实为花特异表达的假基因，由于3个基因都不在根中表达，人们却检测到根提取物的芥子酶活性，因此推测存在更多的芥子酶基因，2001年Nitz等分离到一个根特异表达的葡萄糖苷酶基因Pyk10，由于与芥子酶基因相似性高，认为是芥子酶基因，但是由于没有酶活性测定证据，而且Pyk10不具备芥子酶关键特征位点，因此Pyk10不一定是芥子酶基因，通过Blast分析，我们发现了3个序列高度相似的基因具有芥子酶基因的特征，分别命名为TGG4、TGG5、TGG6，其中TGG4、TGG5在根部特异表达，酵母表达产物具有芥子酶活性，证明是芥子酶基因(待发表)，TGG6在DNA序列上与TGG4和TGG5高度相似，但是在根部检测不到表达。使用TGG4和TGG5的cDNA序列与GenBank中的TGG6基因组DNA序列比对，个别内含子的剪切边界很难确定，因此难以断定TGG6是否是有功能的基因，本研究同时从拟南芥几个生态型克隆了TGG6的核基因和cDNA，通过生物信息学分析，发现TGG6存在移码突变和内含子剪切边界的突变，不能合成有功能的芥子酶，具有假基因的特征，因此推测TGG6是一个假基因。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　拟南芥生态型和种植方法
　　本实验所使用的生态型Col-O、Ba-O、Ws-O来自Nottingham Arabidopsis Stock Center，England，JM1、JM2由作者实验室收集保存，种子播种在标准营养土上，4℃放置3d后转到培养室培养，培养室温度20℃，光照16h/d，光照强度5000lx，
　　
　　1．2　总DNA的提取和，GG6基因的克隆
　　取拟南芥5种生态型植株的叶片，液氮研磨，采用大连宝生物公司总DNA提取试剂盒提取总DNA，以基因特异引物G6F1(5′-ACCCGCTGAAAAGCTCCATCAA-3′)，G6R1(5′-GGCTYCCACTYATITYGCAATGAACC-3′)扩增TGG6基因组DNA，引物由上海闪晶生物公司合成，DNA聚合酶LATaq来自大连宝生物公司，PCR产物克隆在pMD-19T载体中，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，酶切鉴定后，由上海闪晶生物公司测序，每个生态型TGG6基因至少测3个克隆，以排除PCR错误对序列的影响。
　　
　　1．3　RNA提取和反转录
　　分别取新鲜的拟南芥根、茎、叶、花、子叶和绿色角果约50mg，液氮迅速研磨，加入500μLTrizol试剂，剧烈震荡，按照上海申能博彩公司的3S Trizol T0tal RNA Isolation Kit试剂盒说明书进行提取，电泳检测各样品的总RNA质量和浓度，以5μL RNA为模板，合成第一链cDNA，按照上海生工AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书的方法进行，eDNA的合成过体系如下：在一个Eppendorf管中，加入各个组织的总RNA 5μL，oligo(dT)lμL，RNase-Free H2O 6μL，轻弹混匀离心后置于70℃变性5min，立即取出放置冰上30s，然后加入以下试剂：缓冲液4μL，dNTP 2μL，RNase inhibitor 1μL，轻弹混匀离心后37℃反应5min，再加入AMV反转录酶1μL，37℃水浴1h，70℃/10min终止反应。
　　
　　1．4　TGG6基因在拟南芥各器官组织中的表达分析
　　以上述第一链cDNA为模板，用半定量PCR方法扩增TGG6 cDNA，在基因转录水平探讨JPTGG6基因在拟南芥植株中的表达情况，PCR反应体系(50μL)：拟南芥cDNA 100ng(1.5μL)，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上游、下游引物G6F1、G6R1各1姓，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 37μL，反应条件如下：95℃，2min；94℃，30s，56.3℃，45s，72℃，1min 30s，30个循环； 72℃，7min结束反应，以Actl基因的表达作为参照，Actin基因的引物序列为：5′-GGCAAAAGGATGCTFATGTTGG-3′，5′-ATITCACGCTCTGCTGTGGTGG-3′，反应结束后取5μL进行电泳检测，照相。
　　PCR阳性的产物纯化后，连接至pMD-19T载体，进行蓝白斑筛选挑取阳性克隆，酶切鉴定后送上海闪晶生物公司进行序列测定。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2．1　生态型Col-O的TGG6基因的失活突变
　　植物芥子酶基因一般都由12个外显子和11个内含子组成，TGG4和JP7GG5代表一个芥子酶基因新家族，其基因由13个外显子和12个内含子组成(待发表)，TGG6基因序列与TGG4和TGG5相似型较高，基因结构也相似，由13个外显子组成，不过，将生态型Col-O的TGG6核基因序列、cDNA序列与TGG4、TGG5基因序列比较发现，在TGG6中存在4个移码突变，包括第1个外显子中2个碱基的插入突变、第6个外显子中1个碱基的插入突变、第9个外显子中4个碱基的缺失突变以及第12个外显子中17个碱基的缺失突变(图1)，这些突变都使TGG6基因不能编码正确的芥子酶，此外，Col-0的TGG6基因的第10个内含子的3’端剪切边界区域发生9个碱基的缺失突变(与TGG4比较)，导致第10个内含子保留在cDNA中，未被剪切。有趣的是，TGG6第10个内含子的5′端的剪切边界与JP7GG4和JPTGG5-样，是一个异常边界“GC”。
　　　
　　
　　
　　2．2 TGG6在花中特异表达
　　以拟南芥生态型Col-O为材料，从不同器官中提取总RNA，结果如图2所示，由图2可以看出RNA条带整齐，完整性良好，可以满足后续试验的要求。
　　说明第6个外显子的插入突变是TGG6基因最早发生的基因失活突变，它发生在拟南芥生态型分化之前，而其它位点的突变发生在JMl、JM2与Col-0等生态型的分化之后。
　　
　　RT-PCR结果(图3)表明，TGG6基因在花中特异表达，在子叶、根、茎、叶和角果中都检测不到表达。
　　
　　2．3 不同生态型TGG6基因的克隆及多态性分析 分别从Col-O、JMl、JM2、Ws-O、Ba-O等拟南芥生态型克隆TGG6基因组DNA和cDNA，测序后进行序列比较，结果发现，生态型Ws-O和Ba-O与Col-O序列相似性接近100％，具有Col-O的所有移码突变以及第10个内含子的剪切边界缺失，但生态型JMl和JM2仅具有第6个外显子的1个碱基的插入突变，其它突变位点都正常(表1)。
　　　　
　　3 讨论
　　
　　在过去的几十年中，假基因一直被认为是分子化石，是进化中基因突变的遗迹，没有功能，属于“垃圾基因”，与相应的正常基因相比较，假基因缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列等，大多数假基因本身存在着多种遗传缺陷，例如早熟终止密码以及移码突变等等，因而它们的表达受到了抑制，但是近来科学家发现假基因并不是“垃圾基因”，假基因在基因表达、调控以及产生基因多样性等方面可能都扮演着极为重要的角色，但到目前为止，其确切的作用机制仍不清楚。
　　目前已在拟南芥中发现6个芥子酶基因即TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5及TGG6(TGG4、TGG5及TGG6未发表)，其中TGG1、TGG2、TGG4、TGG5已被证实是有功能的基因，TGG3是不能编码完整芥子酶的假基因，本研究通过对5个拟南芥生态型TGG6基因的序列、结构和表达研究，发现TGG6基因在所有5个生态型中都存在第6个外显子的插入型移码突变，导致基因不能编码完整的芥子酶，因此认为TGG6与TGG3一样，是一个假基因，由于TGG6在基因序列中存在TGG4和TGG5中的所有内含子，TGG6是在基因重复发生后，再通过失活突变而形成的，然而，与TGG3一样，TGG6也在花中特异表达，而且TGG6在所有生态型中所共有的移码突变发生在第6个外显子，与TGG3在所有生态型中所共有的移码突变(第5个外显子)的位置非常接近(图4)，这种现象到底是必然还是巧合有待进一步研究。
　　
　　TGGI3由12个外显子组成，TGG4-6由13个外显子组成，其差别来自在TGGl―3中的第5个外显子在TGG4-6中被1个内含子分割为两个外显子，TGG6和TGG3的表达特征与TGGl和TGG2在叶片、子叶、茎、花和角果中表达，TGG4与TGG5在根部表达形成鲜明的对比，这些信息暗示TGG6和TGG3可能还有某种未知的功能，另外，由于TGG6和TGG3的突变发生在基因重复之后，在进化的历史上是否还残留着功能基因，并保存在某个地区的某种生态型中?TGG6和TGG3为什么要发生突变?突变被自然选择所保留的生物学意义是什么?这都是今后研究必须回答的问题。
　　
　　作者简介：汪萌(1981―)，女，山东聊城人，硕士研究生，主要从事生物化学和分子生物学研究；张家明(1966―)，男，湖北公安人，热带生物技术研究所研究员，博士生导师，通讯作者，主要从事作物遗传育种和分子生物学研究。