[在由温度引起的谷氨酸棒状杆菌分批和连续培养中谷氨酸合成和分泌通量的动态分析]谷氨酸棒状杆菌种属

在由温度引起的谷氨酸棒状杆菌分批和连续培养中谷氨酸合成

和分泌通量的动态分析

摘 要

在2262种谷氨酸棒杆菌菌株中，当触发谷氨酸分泌，生长速率就会迅速下降，谷氨酸流出增加. 为了更好的获得对控制该代谢转变因素的定量理解，发酵动力学学者进行了温度敏感株种的批量处理和葡萄糖限制性持续培养的研究。对于在33℃温度下的非分泌细胞，提高生长速度，就会导致中央代谢通量的增长强劲，但对于胞内谷氨酸水平，在氧代戊二酸节点上，酮戊二酸脱氢酶复合体（ ODHC ）活性和磁通分布本质上仍为常数。当温度升高至39℃，无论在高的还是低的代谢活性中，细菌在ODHC 活性中呈现出一个较快的衰减趋势，在谷氨酸合成异柠檬酸脱氢酶的分裂时细菌从28 ％至90％以上，呈现出迅速增长的趋势。同时对于增长率的降低，使细胞活化能力迫使合成过剩的谷氨酸大容量导出系统。

关键词 谷氨酸棒杆菌，谷氨酸分泌物，代谢通量

由谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸是主要的工业发酵过程之一。为了达到高滴定度和高生产率的谷氨酸，发酵操作在激烈的谷氨酸生产阶段后提供了一个快速初始生长期。氨基酸分泌历来是由生物素限制性培养基中的培养细菌诱导的，或通过加入存在去垢剂或抗生素的过量生物素来诱导。最近，也得到了导致谷氨酸生产过剩也包括在较高温度下培养的温度敏感型菌种。必不可少的一个高生产率的过程是快速生长代谢的细菌迅速过渡到能消耗糖，高效地转化为谷氨酸排出体外的细菌。

如今，尽管越来越多的在遗传学，生理学和谷氨酸棒杆菌的代谢研究，但谷氨酸诱导生产的相关机理还没有被确定。然而，在高产菌株中对几个相互关联的生理和代谢的修改进行了论证。

通过所有的触发过程诱导的第一个关键修改是谷氨酸的准瞬间通量. 谷氨酸出口是被假设成一个特定的运输系统，其病变通常归因于细胞膜或细胞壁的属性的改变。

参与中央代谢网络酶活性的改变代表在谷氨酸产生的细胞中，第二类型的生理变型。最重要的是在酮戊二酸脱氢酶复合体（ODHC ）催化下的2- 酮戊二酸为琥珀酰- 辅酶A 氧化脱羧的活性剧烈下降

当加入青霉素或洗涤剂并在温度触发的细胞的生物素限制下，酮戊二酸脱氢酶复合体的活性被发现剧烈降低。 生产谷氨酸棒杆菌细胞中被发现的又一个主要的生理改装是在细胞内谷氨酸浓度的一个重要的减少。正如谷氨酸代表在氮代谢中必不可少的中间体，也被发现施加在中心代谢如PEPC 和GDH 的酶强反馈规定，这减少了谷氨酸含量，可被假定为强烈地影响了细胞的比率增长和谷氨酸合成。 代谢通量调控的关键节点的再分配被认为是在谷氨酸棒杆菌之后的谷氨酸分泌诱导的附加修饰。第一通量修改分布为己糖磷酸途径和埃母登- 迈耶霍夫通路之间，从而使细胞，以满足NADPH 不同的时间需求。据报道另一个关键通量再分配，发生在氧化戊二酸节点，它表示通过三羧酸循环谷氨酸合成和能源生产的代谢分支点。而在生长的细胞中，异柠檬酸磁通估计为75％的三氯乙酸和25％的谷氨酸盐，在分泌细胞中，磁通分流被认为是80％谷氨酸盐。

显然，在谷氨酸流出，ODHC 的活性，细胞内谷氨酸的含量，并在代谢转

变发生代谢通量分布的所有这些报告的修改是密切相关的。但事件之后的触发过程的确切序列尚未阐明。没有控制率的代谢转变因素已经确定。 本研究旨在获得的生理和代谢活动之后的温度敏感型谷氨酸棒杆菌菌株诱导生产谷氨酸中的一个更好的定性和定量的认识。所选择的方法是研究具有广泛不同的代谢活性细菌的代谢转变的动力学，即无论细胞生长在非限制葡萄糖浓度的分批培养下，或在连续培养的葡萄糖限制下。在所有情况下，我们比较了葡萄糖的摄取，细胞生长，谷氨酸盐和乳酸排泄的特定比率的变化，连同ODHC 和谷氨酸盐的胞内水平的变化。利用代谢通量分析，我们也评估在酮戊二酸节点的代谢通量分布的相应的时间变化。

材料和方法细菌菌株

培养基和培养条件。

所使用的菌株谷氨酸棒杆菌2262 ，由欧松庄园的-淀粉SA 提供。培养基的组成是基于由柠檬酸代替去铁胺的MCGC 介质。该培养基含有60克/升分批培养的葡萄糖和15克/升连续培养的葡萄糖。聚丙二醇作为消泡剂。将接种物在33 摄氏度下在补充有NaHPO4 （3.8克/升）和脲（ 0.39毫克/升）的MCGC 培养基中生长，在摇瓶培养。葡萄糖浓度为34克/升，用NaOH 将pH 值设定在

7.6 。谷氨酸棒杆菌的过夜培养物用于接种的3升含有1.5升改进的MCGC 介质的生物反应器（ 阿帕克 ，荷兰）。在分批培养中，培养温度从33摄氏度提高到39 C，培养4小时后，细胞进入指数生长期。连续培养开始变成分批培养，葡萄糖耗尽培养物吸收改进的MCGC ，温度从33提高到39 摄氏度。 用NH3 12 N 将pH 设定点调节在7.6，搅拌设定在1200转来避免氧的限制。

胞外浓度

通过培养，采集样本，以确定生物质和谷氨酸的浓度。通过570nm 处的吸光度（分光光度计）测定细胞浓度，并通过直接称重法，以避免由于细胞形态的变化是误差较大。样品离心（13000转，5分钟 台式微量离心机，贝尔曼公司）后，酶促法测定上清液中的谷氨酸和乳酸浓度（罗氏公司，德国）。

. 一个500微升 样品的胞内谷氨酸浓度的细胞从500微升1-溴六睽酮和1 - 溴庚烷（1.07比重）的通过离心培养的培养基作为分离层和250微升21% HClO4混合物作为固定层64000·G，5分钟和4 ℃ ），将沉淀的细胞用冷冻/解冻过程

的3个周期在酸层被进一步破坏，将所得的萃取液通过加入5M 的KOH 中和。通过离心（32，000·克和4℃）得到的上清液用于细胞内谷氨酸测定。邻苯二甲醛衍生化后，用HPLC 法（休利特帕卡德1090型，法国ULIS ，法国）测定了谷氨酸。这个过程的再现性在一个给定5倍目标范围内是±15%.

ODHC 分析

从培养物中收集的细胞在氯化钾（2克/升）洗涤两次，再悬浮于N-三（羟甲基）甲基-2- 氨基乙烷含有30％（体积磺酸（TES ）- 氢氧化钠缓冲液（100mM ，pH 值7.7）/ v）甘油。细胞在治疗过程中保持在冰中，通过超声破碎（40千赫，8个周期的30和60秒间隔出），并通过离心在44 摄氏度下15分钟后除去10，000·克细胞碎片。无细胞提取液在PD10凝胶柱（LKB-Pharmacia ）上过滤。该ODHC 测定采用仕易奥和淇乔治- 德- EDA的方法。内源性活性定量无1542-酮戊二酸。蛋白质浓度用布拉福德法测定，用牛血清蛋白作为标准来确定。这个过程的再现性在一个给定5倍目标范围内是±20%。

代谢通量分析

使用METAFLUX 程序，用在不同的代谢条件下的氧化戊二酸节点的磁通量进行评价。使用的谷氨酸合成代谢途径概述了清水等人对谷氨酸棒状杆菌的代谢控制分析。通量测定的方法是基于个体代谢的概念图谱排出代谢产物和生物质能生产。一个合成的代谢物的代谢图谱参考生化反应，将我们上述例子中葡萄糖中碳的序列进入代谢产物。它也考虑到消耗中间体和辅因子再生。

例如，个别谷氨酸代谢图谱涉及通过糖酵解将1摩尔葡萄糖转换为2摩尔丙酮酸，通过丙酮酸脱氢酶转化成乙酰辅酶a ，再通过丙酮酸羧化酶糖转化成1摩尔草酰乙酸，丙酮酸羧化酶糖是三羧酸循环反应中回补中的主要的酶。在α-酮戊二酸节点上，1摩尔异柠檬酸盐转化为1摩尔谷氨酸。

葡萄糖摄取需要1摩尔磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）的成丙酮酸的一个额外转换，这过程中生成1摩尔的ATP 。个别谷氨酸图谱也能检其间辅助因子的摩尔平衡：（1）由谷氨酸脱氢酶反应消耗1摩尔NADPH 是由异柠檬酸脱氢酶反应提供的，（2）)NADH 消耗3摩尔能量是通过呼吸道再生反应提供的。（3）所消耗4摩尔的ATP 是通过糖酵解和呼吸反应生成的。

对于乳酸的图谱，将反应序列转换1摩尔葡萄糖转化为2摩尔丙酮酸，并

进一步分成2摩尔乳酸。关于辅因子，用于PEP 的再生和2摩尔NADH 的丙酮酸转化为乳酸消耗2摩尔的ATP ，通过糖酵解途径再生。 用于生产生物质的代谢图谱是基于一个假设的平均大分子组成的细胞和由21种常见的位于中央代谢前体合成这些大分子化合物的化学计量比。个人新陈代谢的图谱首先计算的是前体细胞。一个全体的生物量图谱是通过之后加入通过转化其化学计量组合成生物个体的前体映射的贡献决定的。因此，1克生物质的合成需要约9.3毫摩尔葡萄糖的新陈代谢。沿糖酵解和TCA 循环，生物大分子的合成代谢前体被撤销。一方面，在氧化戊二酸节点上，其余3.9毫摩尔酮戊二酸通过ODHC 方法转化为2.8毫摩尔琥珀酸，另一方面通过GDH 法转化成1.1毫摩尔的谷氨酸。

因此，先确定所产生的代谢产物和生物个体的图谱，然后结合实测的发酵动力学评价细胞内磁通。在一个给定的代谢状态下通过细胞生长的特定比率和代谢产物的排泄来表示其特征，个别葡萄糖汇集对谷氨酸合成做出贡献，乳酸和生物合成是通过个体前体摩尔葡萄糖需求乘以相应的特定的合成率计算。总之葡萄糖摄取速率被确定为不同的贡献的总和。此值与实验测得的葡萄糖摄取率比较来检查所有的代谢贡献使其得到充分的考虑。一旦出现这种情况，在氧化戊二酸代谢通量的节点上，即通量通过异柠檬酸脱氢酶JICDH ， JODHC 通过谷氨酸脱氢酶ODHC 和JGDH ，乘以摩尔ICDH ， ODHC 和GDH 的贡献在于评估由生物质和谷氨酸生产的相应特定比率的谷氨酸和生物量映射的节点，并通过添加这两中物质来实现。

结果

在第一部分的连续非分泌的动力学中，我们调查了对代谢活性增长率和非棒状杆菌分泌的胞内含量的影响。细胞生长在334 C在15克/升葡萄糖的进料的连续培养，稀释率从0.05/ h 增加到0.5/ h 。在稳定状态下测定细胞活性和含量，直到当特定生长率变得等于稀释率。图1显示了在培养基中的生物量浓度，和细胞内特定的ODHC 活性和谷氨酸水平。葡萄糖浓度总是低于1克/升，表示葡萄糖受到限制。在这些条件下没有谷氨酸或其他代谢物被排泄。可见，细胞生长的细胞内谷氨酸的含量没有显著影响，而保持恒定在60毫克/克。同时，特定的 ODHC 活性变化在2和4纳摩尔/分钟毫克蛋白之间的。

图2报道，提高生长率，计算出汇聚的葡萄糖的摩尔量，以及相应的代谢通量JICDH ，JODHC 和JGDH 。所有的通量按比例增加达到特定的生长率，其中在酮戊二酸节点不断分裂分布。异柠檬酸和谷氨酸合成通量达到最大值接近2和0.45 mmol／h 高低温箱，另外当葡萄糖浓度达到4.5毫摩尔/小时高低温箱时。

一个谷氨酸分泌分批培养的动力学

为了调查在快速代谢下，分泌细胞的代谢转换，将细胞分批培养在33 ℃，初始浓度为60g / l的葡萄糖的培养物上。 4小时后，升温至39 ℃。图 3a 和b 显示出了生物质浓度，比生长速率，葡萄糖浓度和葡萄糖消耗速率，谷氨酸的浓度和特定的谷氨酸排泄速率，细胞内谷氨酸和ODHC 活性随时间的变化。如看到的那样，在该温度下偏移大约为0.5 / h 时，特定生长率在最初的几个小时内快速下降到0.1 /小时，然后趋于缓慢。在温度升高不到一个小时时，就在介质中检测出谷氨酸了。在温度改变4个小时后，特定的排泄率稳步上升，达到最大0.6 g / h 。在同一时间，葡萄糖消耗速度从0.7克/小时提高到1.4克/小时。乳酸和海藻糖以较低的利率也被排出体外。在温度变化4个小时后，细胞内谷氨酸从80毫克降低到35毫克，ODHC 活动从5 nmol /分钟的蛋白质降低到无法检测的水平。

图4报告了葡萄糖摄取的摩尔通量，谷氨酸盐和乳酸分泌，以及在接下来4个小时温度变化下，JICDH ，JODHC 和JGDH 在酮戊二酸节点上的通量。葡萄糖通量从5毫摩尔/小时增至7毫摩尔/小时，JICDH 从2毫摩尔/小时提高到4.5毫摩尔/小时，JGDH 从0.5毫摩尔/小时增至4.2毫摩尔/小时。与此相反，JODHC 下降1.3至0.25毫摩尔/小时g 干重。这些细胞内的代谢修饰导致乳酸和谷氨酸盐的排泄通量的增加，降低了细胞的生长速度。

连续培养谷氨酸分泌动力学

细胞首先在温度为33摄氏度，初始浓度为15克/升的葡萄糖中分批发酵。当葡萄糖被消耗时，温度升至39摄氏度，发酵是通过供给以0.05 / h的稀释率，浓度为15克/升的葡萄糖溶液的连续操作方式。正如图5a 和b 所示，在温度变化时，比生长速率是在0.1 / h 左右迅速下降。在连续培养过程中谷氨酸保持非常低的水平，从而特定的葡萄糖消耗速度限制着葡萄糖进料速率，使其约为0.1 G / H 。在温度上升1小时后，在介质中检测出谷氨酸盐。在温度上升4小时后

分泌的比生长速率稳定增加，达到0.04克/小时。没有发现其他的代谢物在这段时间内被排出体外。细胞内的谷氨酸，在33摄氏度时是80毫克， 20小时内随着温度的变化而下降。有趣的是，这个浓度下降比以前在分批培养观察到的要慢得多。

作为细胞内谷氨酸含量的结果一方面来自于谷氨酸合成率与谷氨酸的掺入量和排泄量之间的平衡，另一方面，这个改进细胞的动力学也可以归因于在限制性连续培养下，谷氨酸的利用率和排泄率相对缓慢。图5也显示在温度上升的4小时后，ODHC 比活性迅速下降，蛋白质从6 nmol / min下降至1 nmol / min.mg在8小时后不能检测出活性。

图6中显示的摩尔通量的相应时间的变化随温度改变，表明当葡萄糖涌入，JICDH 保持相对恒定时，JODHC 从0.2毫摩尔/小时快速下降到0.03毫摩尔/小时，JGDH 从0.08毫摩尔/ h增加至0.28毫摩尔/ h。

触发ODHC 活性降低

对温度敏感的2262株谷氨酸棒杆菌中首次发现，在生物素和表面活性剂引发的细胞中观察到ODHC 活性的降低。无论是底或高的代谢活动，在前4小时中，温度在33℃~39℃之间变化，使ODHC 使活性降低看了90％。这个测量时间的减少导致了ODHC 的瞬间抑制，一个渐进式流通量和残留的酶活性的稀释增长

几种机制可能参与在谷氨酸棒状杆菌中生产ODHC 的管理，根据我们的研究结果，谷氨酸棒状杆菌每秒的生长率对酶的表达没有什么强烈的影响，是因为尽管细胞内部ODHC 的通量大约有10倍的变化，但对于在33℃下细胞生长的外部活动只有轻微的变化。ODHC 的表达也可能是由胞内谷氨酸含量控制的。在谷氨酸作为唯一碳源时ODHC 有个强烈的增长信号，还有热敏细胞ODHC 活动和细胞内谷氨酸浓度的降低等共存的发现证实了这个结论(2004年未公开的数据) 。事实上，谷氨酸作为细胞氮代谢的中间产物，ODHC 表达的失活可能代表一种允许谷氨酸在它的分泌物出现后内部浓度恢复的机制。然而这个假说虽然与在高代谢分批培养下ODHC 值和谷氨酸水平值以相同速率下降得到的结果一致，但细胞内谷氨酸含量以一个更慢的速度下降的限制性葡萄糖连续培养的结果却不太支持这个结论。