t细胞受体基因重排是克隆性重排 人ｓＴＮＦＲ１基因的克隆以及在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的稳定表达

　　摘 要：以Hela细胞的总RNA为模板，用RT－PcR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(一)重组质粒亚克隆，将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系，G418筛选稳定转染细胞株，经核苷酸序列测序和酶切鉴定，成功构建了pcDNA3.1(－)－sTNFR1真核表达质粒，脂质体法建立了高效表达sTNFR1的稳定转染细胞系，并经RT－PCR和Westem Blotting鉴定，人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达，为今后的研究打下了基础。
　　关键词：人可溶性肿瘤病坏死因子受体1；克隆；真核表达；稳定转染
　　中图分类号：R575.3
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007－7847(2007)01－0078－06
　　
　　肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor，TNFα)是体内重要的免疫调节因子和炎症介质，它的生物学作用通过受体介导，TNFα过量表达与败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后的排斥反应等疾病的发生有密切相关，而TNFα的可溶性受体(sTNFR1)可中和TNFα的毒性作用，因此sTNFR1有潜在的临床应用价值，本文拟构建sTNFR1的真核表达载体，并在NIH3T3中表达，为下一步sTNFR1用于基因治疗奠定基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌种、细胞株与质粒
　　JM109由我室保存，人Hela细胞株和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)由中南大学肿瘤研究所提供，pGEM-T载体购自Promega公司，真核表达质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司．
　　1.1.2 酶及主要试剂
　　TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、BamH I、EcoR I、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofactamine 2000购自美国Invitrogen公司，TRIzol Reagent RNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清和G418购自美国GIBCO BRL公司，兔抗人sTNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western-blotting检测试剂盒购自博士德公司，ECL试剂盒购自Amersham公司，常用试剂为国产或进口分析纯。
　　1.1.3 引物
　　GAPDH引物：购自北京鼎国生物公司，上游引物序列：5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′;下游引物序列：5′TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA 3′，目的片段452 bp，人sTNFR1扩增用PCR引物参照其cDNA[7]设计，由上海博亚公司合成，上游引物：5′-GAA TCC ATG GAT AGT GTGTGT CCC C-3′;下游引物：5′-GTC GAC GGA TCCTCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，
　　1.1.4 仪器
　　核苷酸测序使用AB1377全自动测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒，由博亚公司完成，Tannon Gis凝胶分析系统为上海天能公司产品，
　　
　　1.2 方法
　　1.2.1 RT-PCR扩增sTNFR1目的片段
　　自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA 3μg，Oligo(18)0.5μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP12.5nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U。加DEPC水至总体积25L，42cI=60min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为cDNA 2μL，TaqDNA聚合酶0.5U，10×Buffer(Mg2+)5μL，10mmol/L dNTP3 4μL，人sTNFRl引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40s变性，55℃40s退火，72℃1min延伸，32个循环后，72℃延伸15 min．
　　1.2.2 构建T载体克隆
　　PCR产物用DNA回收纯化试剂盒回收纯化后与T载体连接，转入感受态大肠杆菌JMl09，经蓝、白筛选，挑选单个阳性克隆，在含有100mg/L氨苄青霉素培养基中过夜生长，提取质粒，用BamH I和EcoR I双酶切鉴定。
　　1.2.3 构建真核表达载体亚克隆
　　将T载体克隆酶切后目的片段，质粒pcDNA3．1(－)用BamH I、EcoR I双酶切后经大齿孔电泳，DNA回收纯化试剂盒回收纯化，将纯化后的两基因片段16℃过夜连接，转入感受态细菌JMl09，挑取阳性克隆，接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养过夜生长，提取质粒，BamHI和EcoR I双酶切鉴定，并且核苷酸测序证实。
　　1.2.4 重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的筛选
　　在6孔板中接种NIH3T3细胞(每毫升2×105个细胞)，37℃、5％C02的培养箱中培养18～24h，待细胞生长至90％－95％满时分别用重组质粒(pcDNA3.1(－).sTNFRl)和空质粒(pcDNA3.1(－))进行转染，并设阴性对照(仅有培基，不加质粒DNA)，具体操作按脂质体Lipofac－tamine 2000说明书进行，转染后96h，改用选择性培基(G418浓度前两天为250mg/L，后为500mg/L)，隔日换液，一共选择培养16d，至阴性对照孔细胞全部死亡，后降G418浓度为250mg/L，第18d后陆续挑取6个单克隆细胞(分别编号为N1－6)扩大培养．建立稳定传代的转染细胞株pcDNA3.1(-)-sTNFR1/NIH3T3(PSR/NIH3T3)。
　　1.2.5 重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的鉴定
　　1)对PSR/NIH3T3 6个细胞系进行RT-PCR分析，pcDNA3.1(－)/NIH3T3(P/NIH3T3)和NIH3T3作对照，筛选sTNFR1 mRNA有表达的真性克隆，细胞RNA的提取步骤同上，在紫外分光光度仪上检测RNA的质量及浓度后进行RT-PCR，取总RNA3 μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP3 12.5 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U，加DEPC水至总体积25μL，42℃60min逆转录；逆转录后产物为cDNA，取cDNA2μL，加入10×PCR Buffer 5μL，dNTP3 20nmol，sTNFR1上游及下游引物各50pmol，GAPDH上游及下游引物各50pmol，TaqDNA聚合酶3U，加双蒸水至总体积50μL。置PCR仪中，循环温度及时间为：95℃5min；随后以3步循环(94℃40s，55℃40s，72℃1min)扩增DNA，共32个循环；最后72℃10min延伸，反应结束后取PCR产物8μL，1.2％琼脂糖凝胶电泳照相。
　　2)对RT-PCR鉴定的5个单克隆细胞株取其中1株作Western-blotting鉴定，并以P/NIH3T3和NIH3T3作对照：将100mL培养瓶中的细胞，用冰预冷PBS洗一次，加入1mL裂解缓冲液，冰浴20min，用细胞刮刮下细胞，将裂解缓冲液及细胞碎片吸入一预冷的EP管中；4℃下10000r/min，离心2min；将上清液吸人一新EP管，保存于－70℃二将蛋白与加样缓冲液1:1比例混合，100℃煮沸5min；10000r/min离心5min；上清用于加样。
　　将收集的上清液进行SDS-PAGE电泳分离后，将细胞蛋白转移到PVDF膜上，100V、4℃转移电泳70min，转膜完毕经丽春红染色可见有目的蛋白条带，TBS洗涤两次，用含5％脱脂奶粉的TBST 37℃封闭1h，将PVDF膜与兔抗人sTNFR1多克隆抗体(浓度0.1mg/L)温育2h，TBST洗涤5minx3后。与HRP标记的羊抗兔IgG(1:3000)室温孵育1h，TBS洗涤10min×3，0.1mL/em2量加ECL发光试剂，暗室内曝光X光胶片，常规方法显影、定影。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 sTNFR1基因片段的扩增及纯化
　　经扩增的sTNFR1的基因片段的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳可见558bp大小的DNA条带(图1)。
　　
　　
　　2.2 T载体克隆的构建
　　将纯化的PCR产物与T载体连接后转入感受态大肠杆菌JM109，以对目的片段大量扩增，经对阳性克隆质粒提取及酶切鉴定，证实成功构建T载体克隆(图2)。
　　
　　2.3 sTNFR1基因真核表达的亚克隆
　　将酶切、纯化后的目的片段与表达载体pcD―NA3.1(-)连接，转化入感受态细菌JM109，获得含peDNA3.1(-)-sTNFR1重组表达质粒基因工程菌，并经酶切(图3)及核苷酸测序证实(图4)。
　　
　　
　　
　　2.4 sTNFR1的稳定转染细胞株的鉴定
　　1)RT-PCR检测sTNFR1 mRNA的表达
　　扩增培养单克隆细胞，提取细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳及紫外扫描两种方法检测示RNA抽提质量较好(图5)，RT-PCR的结果表明PSR/NIH3T3、P/NIH3T3、NIH3T3细胞中均不同程度地扩增出sTNFR1的mRNA.经扩增产物密度半定量检测有5株PSR/NIH3T3的sTNFR1为高水平表达(表1、图6)。
　　
　　2)Western-blotting检测sTNFR1高表达细胞株
　　PSR/NIH3T3单克隆株N1、P/NIH3T3细胞株和NIH3T3细胞株均在30kD处有sTNFR1蛋白表达，以β-actin为内参照，PSR/NIH3T3单克隆株N1蛋白质表达强度明显高于P/NIH3T3细胞株和NIH3T3细胞株(图7)，经Western-blotting鉴定，PSR/NIH3T3单克隆株N1为稳定转染细胞株。
　　
　　
　　3 讨论
　　
　　肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)是由激活的单核巨噬细胞分泌的，具有多种生物学效应的细胞因子，它的生物学功能是通过与细胞表面TNFα受体的结合来实现的，TNFα受体有两种――TNFR1(55 kD)和TNFR2(75 kD)，均为糖蛋白，其中TNFR1介导了大部分TNFa的生物学功能，如抗病毒、诱导凋亡，活化NFKB，成纤维细胞增殖等，TNFR的两种受体(TNFR1和TNFR2)均可分两种类型，膜结合型(mTNFR)和可溶型(sTNFR)，可溶性受体为膜结合型受体胞外区在TNF转换酶(TACE)的作用下从细胞膜上解离下来，游离在血液中，仍可与TNFa结合，但无法介导TNFa的信号传导，因此，sTNFR能竞争性地与TNF分子结合，形成可溶性TNF-sTNFR复合物，间接抑制TNFa的生理作用，有研究表明，体内TNFα的过度表达在多种疾病的发生发展病理过程中发挥着重要作用，如：败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后排斥反应等，因此，应用sTNFR1抑制TNFa的生理作用，以治疗TNFa介导的疾病有着重要的意义，尽管sTNFR1属内源性物质，但从体液中直接提取sTNFR1的量有限，难以满足临床治疗与诊断的需要，利用基因工程的方法生产sTNFR1有深远的研究和应用价值。
　　人sTNFR1是一种具有生物学活性的分泌性蛋白，国内高波等利用杆状病毒穿梭载体Bacmid转染sf21昆虫细胞，获得了高效表达，而我们将sTNFR1cDNA重组在真核表达载体pCDNA3.1(-)中，该载体在多克隆位点的上游及下游分别带有CMV的启动子和BGH的poly A尾，这种强有力的巨细胞病毒的增强启动子序列，能高效表达插入的目的基因，并且可在广泛的宿主细胞中工作，本研究从人Hela细胞提取总RNA，自行设计并合成sTNFR1两条引物，通过RT-PCR获得了的558bp大小的目的片段sTNFR1全编码的基因，构建了重组质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1亚克隆，经酶切及和核苷酸测序，证实获得pCDNA3.1(-).sTNFRl重组基因工程菌，将测序因子与Loetscher等报告的序列比较，结果完全一致，无移码突变，sTNFR1真核表达载体的构建为下一步基因转染，表达目的蛋白奠定了基础。
　　NIH3T3为小鼠成纤维细胞株，来源于Swiss小鼠胚胎，早在1962年建系，本研究之所以选用NIH3T3作为基因转导的载体细胞是因为成纤维细胞容易在体外培养及大量扩增，其回输的方法也及其简单，在动物实验中，可以直接注射入受体的腹腔或皮下，已有大量的将不同细胞因子基因转入成纤维细胞的报道，这些细胞因子在成纤维细胞中均能稳定的表达，在血友病的基因治疗中，Roth等用电穿孔法将FⅧ因子基因导入甲型血友病患者离体成纤维细胞，筛选出能分泌FⅧ蛋白的成纤维细胞，克隆扩增后注入患者腹腔，6例接受治疗的患者有4倍血浆FⅧ水平明显增高，出血症状改善并持续10个月之久，成功地采用成纤维细胞作为基因治疗的靶细胞用于治疗血友病，故本研究选取NIH3T3细胞系作稳定转染。
　　本研究选用Invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectamine 2000，其转染条件稳定，转染效率高．我们根据产品说明书确定脂质体悬液用量为10μL，DNA用量为4μg，选定6/h为脂质体－DNA复合物和细胞的孵育时间，成功地将重组质粒转入NIH3T3细胞，并筛选出稳定表达的PSR/NIH3T3细胞系，在鉴定PSR/NIH3T3的实验过程中发现，不论是P/NIH3T3还是NIH3T3均有sTNFR1的表达，但PSR/NIH3T3细胞中的sTNFR1表达量，不论是mRNA水平还是蛋白表达水平均明显高于P/NIH3T3和NIH3T3，说明转入细胞内的基因能有效表达．PSR/NIH3T3稳定转染细胞系的建立为利用该细胞系进行基因治疗的实验研究打下了基础。
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文