半枝莲总黄酮提取工艺优化研究 [袋花忍冬总黄酮的提取工艺优化]

　　摘要：采用Ｌ９（３４）正交试验设计，以袋花忍冬总黄酮含量为考察指标，考察了乙醇体积分数、提取时间、乙醇用量、提取次数４个因素对提取量的影响。结果表明，袋花忍冬最佳提取工艺为１０倍量７０％乙醇提取两次，提取时间１ ｈ。该工艺经重现性好，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
　　关键词：袋花忍冬；总黄酮；正交试验；提取工艺
　　中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1669-02
　　
　　Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｎｉｃｅｒａ sａｃｃａｔａ
　　
　　ＤＡＩ Ｘｉａｎ－ｐｉｎｇ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｂｉｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙａｎｔａｉ ２６４００３， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｓａｃｃａｔａ Ｒｅｈｄ． ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ Ｌ９（３４）． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｒｅｆｌｕｘ ｄｕｒａｔｉｏｎ， ｅｔｈａｎｏｌ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ １０－ｆｏｌｄ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ， １ ｈ ｏｆ ｒｅｆｌｕｘ， ａｎｄ ２ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ， ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｗｏｒｔｈｙ ａ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｓａｃｃａｔａ Ｒｅｈｄ.； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　　
　　袋花忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｓａｃｃａｔａ Ｒｅｈｄ.）为忍冬科忍冬属（Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌｉｎｎ）植物，落叶灌木，广泛分布于我国陕西、甘肃、青海、四川、重庆、贵州、云南及西藏等地［１］。其主要活性成分为黄酮类化合物［２，３］，具有抑菌、抗病毒、消炎、降低血压、抗癌、调节免疫等作用［４，５］。长期以来对袋花忍冬黄酮类化合物的提取研究甚少，而采用正交试验对袋花忍冬进行黄酮类化合物提取的研究尚未见报道。因此通过对袋花忍冬总黄酮成分提取工艺的研究，旨在为进一步合理开发袋花忍冬提供参考依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　袋花忍冬采自重庆奉节县，由滨洲医学院药学院天然药物化学研究室鉴定为忍冬科忍冬属植物袋花忍冬的干燥全草，芦丁对照品由中国药品生物制品检定所提供，其他试剂均为分析纯。
　　ＴＵ－１９０１双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），ＲＥ－２０００Ａ旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），ＡＬ１０４电子天平（梅特勒－ 托利多仪器有限公司），Ｂ－２２０型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂），ＤＺＦ２６０２１型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）。
　　１．２方法
　　１．２．１提取溶剂的选择
　　１）水提取法。精密称取袋花忍冬５ ｇ，加水５０ ｍＬ浸泡３０ ｍｉｎ后，在水浴中加热回流提取１ ｈ，趁热过滤，共提取２次，合并滤液至２００ ｍＬ容量瓶中，药渣用水洗涤２～３次，一并纳入滤液，冷却后用水定容，摇匀，待用。
　　２）乙醇提取法。精密称取袋花忍冬５ ｇ，加乙醇５０ ｍＬ浸泡３０ ｍｉｎ后，水浴回流１ ｈ，趁热过滤，共提取２次，合并滤液至２００ ｍＬ容量瓶中，药渣用乙醇洗涤２～３次，一并纳入滤液，冷却后乙醇定容，摇匀，待用。
　　１．２．２正交试验选用乙醇体积分数、提取时间、乙醇用量及提取次数４个因素，每个因素设３个水平，以袋花忍冬中总黄酮提取量为考察指标，按Ｌ９（３４）正交试验表进行试验，因素与水平设计见表１。
　　
　　１．２．３总黄酮含量测定
　　１）标准曲线的制备。精密称取在１２０℃干燥至恒重的芦丁对照品５０ ｍｇ，置５０ ｍＬ容量瓶中，加乙醇约３０ ｍＬ，置水浴中微热使溶解，冷却后加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取１０ ｍＬ，置１００ ｍＬ容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每毫升含芦丁对照品０．１ ｍｇ） 。精密量取对照品溶液０、１．００、２．００、３．００、４．００、５．００ ｍＬ，分别放入１０ ｍＬ容量瓶中，各加水至５ ｍＬ，精密加５％亚硝酸钠试液０．３ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ，加１０％硝酸铝试液０．３ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ，加４％氢氧化钠试液２．０ ｍＬ，再加水至刻度，摇匀，放置１５ ｍｉｎ。按照分光光度法［６］，在５１２ ｎｍ波长处测定吸光度，以吸光度（Ａ）为纵坐标，浓度（Ｃ）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Ａ ＝０．０６５ ４Ｃ＋０．００２ ３，ｒ＝０．９９９ ８，线性范围为９．３２７～５０．２３６ ｍｇ／Ｌ。
　　２）样品液总黄酮含量测定。精密量取样品液２ ｍＬ，置１０ ｍＬ容量瓶中，按标准曲线制备方法进行操作，测定吸光度，由回归方程计算样品中总黄酮含量。
　　２结果与分析
　　２．１提取溶剂的选择
　　由表２结果可见，乙醇提取法优于水提取法。用水作溶剂提取总黄酮虽然存在生产成本低，无溶剂残留的优点，但提取率较低，且提取液存放易腐败变质，后续的过滤、浓缩等操作困难且费时等。因此选择乙醇作为提取溶剂。
　　２．２正交试验结果分析
　　以袋花忍冬中总黄酮含量为考核指标，正交试验结果见表３。由表３可知，影响袋花忍冬总黄酮提取量的主次因素依次为乙醇体积分数＞提取次数＞乙醇用量＞提取时间，提取的最佳方案为Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２，即１０倍量７０％乙醇提取两次，提取时间１ ｈ。方差结果表明，乙醇体积分数对总黄酮提取量有显著性影响（Ｐ＜０．０５）。
　　２．３提取工艺的验证试验结果
　　为进一步考察上述最佳工艺的稳定性和合理性，按该工艺条件进行３次重复性试验，分别测定袋花忍冬总黄酮的含量，结果分别为４．３５、４．２６、４．２９ ｍｇ／ｇ。测定的结果较优，且重现性好，说明该工艺稳定可行。
　　３结论
　　袋花忍冬总黄酮是袋花忍冬的主要成分，经正交试验，发现影响袋花忍冬总黄酮提取量的主次因素依次为乙醇体积分数＞提取次数＞乙醇用量＞提取时间，提取的最佳方案为１０倍量７０％乙醇提取两次， 提取时间１ ｈ。按此方案提取，所得总黄酮含量最高，而且工艺简单、操作控制容易、稳定性好，适合于工业化生产。
　　参考文献：
　　［１］ 中国科学院中国植物志编辑委员会． 中国植物志［Ｍ］． 北京： 科学出版社，１９８８．
　　［２］ 胡润淮，袁珂，孙德梅． 忍冬叶中绿原酸和总黄酮分离工艺的研究［Ｊ］． 河南科学，１９９９，１２ （４）：３８２－３８４．
　　［３］ 颜承云，谷继伟． 忍冬果实黄酮类成分总含量的动态分析［Ｊ］． 中国野生植物资源，２００４，２３（２）：５１－５２．
　　［４］ ＫＡＫＵＤＡ Ｒ， ＩＭＡＩ Ｍ， ＹＡＯＩＴＡ Ｙ． Ｓｅｃｏｉｒｉｄｏｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ［Ｊ］ ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，５５（８）：８７９－８８１．
　　［５］ ＫＵＭＡＲ Ｓ， ＳＡＴＩ Ｏ Ｐ， ＳＥＭＷＡＬ Ｖ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｉｒｉｄｏｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｑｕｉｎｑｕｅｌｏｃｕｌａｒｉｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，５３（４）：４９９－５０１．
　　［６］ 国家药典委员会． 中国药典（一部）［M］． 北京： 化学工业出版社，２００５．
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