反相高效液相色谱法测定瓦尼木层孔菌中柚皮素的含量_反相高效液相色谱原理
采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii）中柚皮素含量。瓦尼木层孔菌醇提物水解后采用RP-HPLC对柚皮素的含量进行测定，色谱条件：Hypersil ODS（4.6 mm×100 mm， 3 μm）色谱柱，流动相为1%冰醋酸溶液-甲醇（62∶38），柱温为40 ℃，流速为0.6 mL/min，检测波长为 288 nm。标准曲线为A=4.18×106X+40109(r=0.9998，n=5)，柚皮素进样量在0.0202～2.020 μg间线性关系良好，相对标准偏差（RSD）为1.56%（n=5），回收率为97.8%，重现性实验RSD为1.76%。该法适于瓦尼木层孔菌醇提物中柚皮素的含量测定。
反相高效液相色谱法； 瓦尼木层孔菌； 柚皮素
瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii）俗称桑黄，寄生于杨树者称杨黄，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），锈革孔菌科（Hymenochaetaceae），木（针）层孔菌属（Phellinus）［1］，有“森林黄金”之美称。瓦尼木层孔菌具有抗肿瘤、抗炎、抗血管生成等多种药理作用［2-4］，中国传统中药中常用于治疗痢疾、盗汗、血崩等［5］。已有学者从中分离出柚皮素、樱花亭、北美圣草素、香豆素等化学成分［6,7］。其中柚皮素具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆等作用［8］。笔者尝试建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定瓦尼木层孔菌中柚皮素含量的方法，为其质量研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1材料
瓦尼木层孔菌（P. vaninii，寄主为杨树）子实体购自吉林省延吉市特产经营部，由江苏大学药学院张朝晖教授鉴定为真品。
1.2主要试剂和仪器
柚皮素（对照品，南京泽朗医药科技有限公司，经HPLC测定纯度大于98%）；SCL-10Avp型高效液相色谱仪（日本岛津公司），UV-2401紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。
1.3瓦尼木层孔菌醇提物制备
瓦尼木层孔菌子实体粉末过60目筛，取 15 g置烧瓶中，加450 mL 70%乙醇，室温下浸泡 12 h，超声30 min，抽滤，残渣用450 mL 70%乙醇再超声提取一次，合并两次滤液，浓缩，干燥，得瓦尼木层孔菌醇提物。
1.4瓦尼木层孔菌醇提物的水解
精密称取1.0 g瓦尼木层孔菌醇提物，加100 mL 2%的硫酸，直火加热回流30 min水解。放冷，40% NaOH溶液调至中性，加等量乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯层，浓缩后烘干，得待测样品。
1.5溶液配制
对照液：精密称取柚皮素对照品50 mg，置50 mL量瓶，加甲醇定容，得1 mg/mL对照液；供试液：精密称取样品400 mg，置25 mL量瓶，加甲醇超声溶解后定容。
1.6色谱条件
取对照液，紫外可见分光光度计上200～ 500 nm波长范围内扫描，确定288 nm为测定波长。SPD-10Avp型紫外-可见检测器，Class-VP系统，色谱柱为Hypersil ODS（4.6 mm× 100 mm， 3 μm）色谱柱，流动相为1%冰醋酸溶液-甲醇（ 62︰38），柱温为40 ℃，流速为0.6 mL/min，进样量20 μL。
1.7系统适应性及专属性实验
分别取对照液和供试液，用流动相稀释40倍，微孔滤膜过滤后进样，考察HPLC谱图。
1.8线性范围测定
分别精密吸取对照液0.01、0.02、0.10、 0.20、1.00 mL置10 mL量瓶，用流动相稀释至刻度线，各进样20 μL，按色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积为纵坐标，柚皮素质量为横坐标，绘制标准吸收曲线。
1.9精密度实验
在室温条件下，精密吸取对照液2.5 mL，置100 mL量瓶用流动相定容，连续进样5次，每次进样20 μL，记录吸收峰面积。
1.10重现性实验
在室温条件下，精密称取样品400 mg共5份，置25 mL量瓶，加甲醇超声溶解后定容，取 2.5 mL置100 mL量瓶，用流动相定容，微孔过滤，分别进样20 μL，记录吸收峰面积。
1.11加样回收实验
在室温条件下，精密称取一定量已知含量样品，分别加适量对照液，超声溶解，按上述拟定方法测定柚皮素含量，计算回收率。
1.12样品含量测定
按上述拟定方法测定3批瓦尼木层孔菌中柚皮素含量。
夏国华，等：反相高效液相色谱法测定瓦尼木层孔菌中柚皮素的含量
2 结果与分析
2.1系统适应性及专属性
按1.7项下操作，得色谱图1、2，在上述色谱条件下，样品液在柚皮素峰相应位置都有一显著峰，结果表明该柚皮素与瓦尼木层孔菌中其他成分有较好的分离效果，色谱系统适应性及专属性良好。
图1 柚皮素对照品液HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of naringenin standard
图2 供试液HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatogram of P. vaninii sample
2.2线性范围
回归得柚皮素质量（X）与峰面积（A）的关系：A = 4.184643 × 106X + 40109（r = 0.9998），表明柚皮素进样量在0.0202～ 2.020 μg内，峰面积（A）与质量（X）之间呈良好的线性关系。
2.3精密度、重现性和稳定性
由峰面积计算柚皮素质量，RSD=1.56%，表明仪器和色谱条件均具有良好的精密度。
由峰面积计算柚皮素质量，RSD=1.76%，结果显示该仪器和色谱条件下的方法具有良好的重现性。