非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化|蛋白酪氨酸激酶的研究过程
230 论著
ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2004,20(2)
文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04
非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化
单保恩1,董 青1,李宏芬1,陈 晶1,董金琢2,马 洪2
(1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD技术公司,Mo63021,美国)
Extractionandpurificationofnon-recep-tortypePTKs-Syk
SHANBao-en,DONGQing,LIHong-fen,CHENJing1,DONGJin-zhuo2,MAHong2
1
Syk蛋白。方法:将syk基因转染Sf21细胞,于28 培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow-3凝胶和Toyopear-lAF-Heptin-650M凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk蛋白存在和性质,用SDS-PAGE、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk的225mg蛋白质。经Yellow-3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk蛋白,相对分子质量(Mr)均为72 103。进一步用Toyopear-lAF-Heptin-650M凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹实验结果显示,两种Syk的Mr均为72 103,与Syk的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk蛋白成分具有不同的pI值。结论:从25亿个转染syk基因的Sf21细胞中纯化出8mgSyk蛋白,纯度高于95%。这两种Syk的Mr虽然相同,但具有不同的pI值,是两个亚种。这些Syk可用于研究Syk的作用机制、抗Syk抗体的制备和Syk诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11 文献标识码:B
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ResearchCenter,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;2MDTechnologiesInc.845PheasantWoodsDriveManchester,Mo63021,USA
Abstract
AIM:ToextractandpurifySykproteinfromSf21cellstransfec-tedbysykgene.METHODS:Sf21cellsweretransfectedwithrecombinantsykgene.After48hofincubationat28 ,thetransfectedcellswerecollectedandsonicatedwithSonfierson-icatoronice.FilteredcellextractwasloadedontoaReactiveYellow-3resincolumnandToyopearlAF-Heparin-650Mcolumnrespectively.ThecharacterofSykproteininthefractionswereidentifiedbySDS-PAGE,WesternblottingandIEF.RESULTS:225mgofproteincontainingSykwereobtainedfromSf21cells(2.5 109)extract.Thereweretwosubpopulationsintheelu-tionofReactiveYellow-3resincolumnwiththesamerelativemolecularmass(Mr)72 103.ThetwosubpopulationswerethenappliedonToyopearlAF-Heparin-650Mcolumnandtwopureproteinswereobtained.TheresultsofSDS-PAGE,Wes-ternblotting,andIEFshowedthetwoproteinshavingthesamerelativemolecularmass(72 103),correspondingtoSyk,butwithdifferentpI.CONCLUSION:TheyieldofSykwas8mgfrom2.5billioncellsandthepuritywas>95%.ThetwopurifiedSykproteinshavethesameMranddifferentpI.ThepurifiedSykproteincanbeappliedtostudySyk smechanism,produceant-iSykantibodyandinventSykdiagnosiskit,etc.Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf21cells
非受体型酪氨酸激酶(spleentyrosinekinase,Syk),是一种B细胞激活信号转导中最重要的激酶
[1]
,与T细胞激活中的ZAP-70属于同一个PTK家
族,Mr为72 103。Syk在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I-TAM招募的首选对象。被招募的Syk立即成为Src作用的第二个靶目标,进而启动B细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白。
摘要
目的:从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子
收稿日期:2003-06-07; 修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师.
Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.com.cn
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1 材料和方法
1.1 材料 兔抗Syk抗体购自美国SantaCruz生物技术公司。酶标记绵羊抗兔二抗购自美国LexingtonKY转导实验室。蛋白Mr标准品[Mr(14~97) 103\ 和ECL购自华美公司分装的AmershanPharmaciaBiotech公司产品。PVDF膜使用Millipore产品。其他化学试剂均为分析纯。1.2 方法
1.2.1 细胞株及细胞培养 Sf21细胞株来源于黏虫卵巢组织(Spodopterafrugiperda),由美国Inritrogen提供
[4]
Yellow-3层析柱(2.5 10cm,Sigma),用两倍体积的缓冲液(20mmol/LNa-Pi,pH7.4,1mmol/LEDTA,1mmol/LEGTA,1mmol/LDTT)和1倍体积的含有200mmol/LNaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含0.2~1mol/LNaCl的缓冲液洗脱,层析液中的Syk蛋白用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测。
含有Syk的层析成分分别被收集到一起,用含有200mmol/LNaCl的缓冲液透析2h,再加入ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱(2.5 12cm,Sigma)层析柱中,用含200mmol/LNaCl的缓冲液平衡后,Syk蛋白用含有(0.2~1)mol/L浓度梯度NaCl的缓冲液洗脱,层析成分用SDS-PAGE和免疫印迹分析Syk蛋白的存在。
1.2.5 蛋白电泳和免疫印迹实验 细胞溶解物或层析液进行SDS-PAGE分离(分离胶浓度为100g/L),凝胶用CBB-R250染色确认蛋白条带,并将此凝胶上的蛋白转移至PVDF膜,蛋白Marker用Ponceans(Sig-ma)染色。PVDF膜用30g/LBSA(BSA溶于TBST缓冲液:1mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl和1mL/LTween20)封闭1h后,与抗Syk抗体(用TBST作1 20000稀释),室温反应1h。用化学发光显色系统显色(ECL,AmershanPhamaciaBiotech)。
1.2.6 等电聚焦实验 Syk的等电聚焦实验应用PhamaciaphastSystem和IEFPhastGel系统,按产品说明书操作。
。Sf21细胞应用Grace s培养基(含100mL/L
FCS,10g/L抗菌素和抗霉菌素)(Gibco-BRL)进行培养[5]。将细胞调整到1 109/L左右的密度,用培养瓶(BellcoGlassInc.Vineland,NJ)于恒温摇床(80~100r/min)26~28 进行培养。经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95%~100%。
1.2.2 重组syk基因的杆状病毒制备 应用Luckow建立的Bac-to-Bac方法进行制备[6]。该方法是基于在大肠杆菌中点特异性转录重组病毒的产生特性,表达水平较高,是较理想的基因表达载体。
1.2.3 纯化baconidsykDNA 应用脂质体介导技术[7],将转染syk基因的Sf21细胞于28 培养4~6d,用cellfectin试剂(Gibco-BRL)进行选择培养,收集细胞制备sykDNA。应用O Reill等[7]报道的噬菌体纯化法纯化病毒颗粒。经培养一些孔形成噬菌斑,将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测,有Mr为72 10蛋白条带的存在。
1.2.4 Sf21细胞的大量制备及Syk的分离、纯化 于3L培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0~1.2) 106/mL],加入25mL病毒贮存液( 2.5 108pfu/mL),于恒温摇床(80~100r/min)28 培养48h进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖
[8]
3
2 结果
2.1 从Sf21细胞中提取蛋白质 将转染syk基因的Sf21细胞(2.5 109)与细胞裂解液共同孵育30min,再用超声波破碎仪震荡裂解。裂解液经100000g离心,收集上清液,用0.2 m滤器滤过,从细胞裂解液中获取了225mg蛋白质。
2.2 SykYellow-3层析柱的分离和初步纯化 将从Sf21细胞提取的蛋白质,用Yellow-3层析柱分离得到两个Syk层析成分(图1A黑色区域,表示23~33和34~41两个层析成分的峰值),析出两个Syk的盐浓度梯度(虚线)分别在(420~500)mmol/L和(550~650)mmol/LNaCl之间。SDS-PAGE分离结果显示,23~33和34~41两个层析成分均含有单一的蛋白条带,Mr为72 10(图1B)。免疫印迹结果显示两种蛋白质均为Syk(图1C)。
3
。收集细胞悬液低速离心(500g,7min),将细
9
胞沉淀物(2.5 10)与细胞裂解液(20mmol/L磷酸钠pH7.4,1mmoL/LEDTA,1mmol/LEGTA,1mmol/LDTT,1mL/LTriton-100,200mg/L抑蛋白酶肽,50mg/L亮抑蛋白酶肽,10mmol/L焦亚硫酸钠)共同培养30min,于冰浴中用超声波破碎仪(BransonsonicPowerCo.Danburg.CT)震荡裂解3次,每次30s(设定输出功率为 3 档)。将细胞裂解液于4 100000g离心60min(贝克曼LE-80K超速离心机)。收,
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2.4 Syk的等电聚焦分析(IEF) 经ToyopearlAF-Heptin-650M纯化的两个Syk成分用免疫印迹分析虽显示相同结果,但经IEF分析,这两个Syk具有不同的pI值(图3)。
图3 Syk蛋白的等电聚焦分析(IEF)结果
Fig3 Isoelectricfocusing(IEF)ofthetwoSykproteinspurified
throughaToyopearlAF-Heparin-650Mcolumn
图1 Yellow-3柱层析纯化Syk结果
Fig1 PurificationofSykthroughaReactiveYellow-3resincolumn
A:ThechromatogramoftheelutionfromtheReactiveYellow-3resincolumn.Thesaltgradientusedintheelutionfromthecolumnisshownasadashedline.B:TheresultsofSDS-PAGE.M:Molecularweightmarker;S100:TheextractofSf21cells;FT:Flowthrough.Theotherlanesarefractions23to42.C:WesternanalysisconfirmstheidentityoftheMr72 103proteinbandasSyk.
Note:Lane1andlane2arerespectivelyfractions23-33and34-41puryfiedthroughToyopearlAF-Heparin-650Mcolumn.ThetwoSykshoweddifferentpI.
2.5 获得Syk蛋白的不同纯化过程的总结 经SDS-PAGE分离,CBB染色结果显示,细胞裂解产物出现多条蛋白条带(图4A泳道1)。细胞裂解产物经100000g离心后的上清液也出现多条蛋白条带(图4A泳道2)。但经Yellow-3凝胶层析(泳道A3),并进一步用ToyopearlAF-Heptin-650M层析纯化后,显示单一的Syk特异性蛋白条带(泳道A4)。免疫印迹结果显示,Mr72 103的蛋白质为Syk(图4B)。
2.3 ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱进一步纯化Syk 经Yellow-3凝胶层析分离的23~33层析成分进
一步用ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱分离,得到了单一的蛋白质峰(图2A,)。同样,34~41层析成分经ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱分离,得到了单一的蛋白质峰(图2B)
。
图4 不同Syk样品经SDS-PAGE分离(A),CBB染色和抗Syk
抗体免疫印迹结果(B)
图2 Syk成分进一步用ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱分离
的结果
Fig2 PurificationofSykthroughaToyopearlAF-Heparin-650Mco-l
umn
A:No.22-33fractionsofReactiveYellow-3resincolumn;B:No.34-41frac-tionsofReactiveYellow-3resincolumn.Thedarkenedareashowsthepeakconsistingoffractions22-28containingSyk.
Fig4 SamplesweresubjectedtoSDS-PAGEandanalyzedbyCoomassiestaining(A)andwesternblottingwithant-iSykantibodies(B)
M:Proteinmarker;1:Wholecelllysate;2:100000gsupernatant(S100);3:CombinedSykcontainingfractionfromtheReactiveYellow-3chromatogra-phy;4:CombinedSykcontainingfractionfromthechromatographyonToyopearlAF-Heparin-650Mresin.
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2.6 Syk蛋白的产量 从25亿个Sf21细胞中经Ye-llow-3层析分离和ToyopearlAF-Heptin-650M层析纯化,得到了8mgSyk,纯度高于95%(表1)。
表1 从Sf21细胞中制备和纯化重组Syk
Tab1 PurificationandYieldofRecombinantSykfromSf21Cells
PurificatorystepCelllysateYellow-3column23~33fraction34~41fractionToyopearlAF-Heptin- 650Mcolumn23~33fraction34~41fraction
3.524.45
3.55
14.415.6Totalprotein(mg)
225
ratiooftotalprotein(%)
10013.3
等电聚焦分析(IEF)具有不同的pI值。
以前,应用普通的SephercrylS系列凝胶层析柱分离Syk蛋白,回收率较低(从25亿个Sf21细胞中得
到5.5mg蛋白质),得到的Syk蛋白质的纯度较低(75%)。为了得到高回收率、高纯度的Syk蛋白,我们对Sigma公司销售的多种亲和层析柱进行了筛选,结果显示,经Yellow-3和ToyopearlAF-Heptin-650M两种亲和层析柱联合分离、纯化,最终得到了8mgSyk,纯度高于95%,是Syk较理想的联合纯化方法。这些Syk可用于研究Syk的作用机制,进行抗Syk抗体和诊断用试剂盒的制备等用途。
参考文献:
[1]单保恩,董 青,王晓玲,等.兔抗Syk抗体制备和在乳腺癌诊断
中的应用[J].细胞与分子免疫学杂志,2003,19(5):458-460.
3 讨论
Syk在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2],而近来对Syk与肿瘤相关性研究证实,Syk可以抑制多种恶性肿瘤生长,从而引发了对非受体酪氨酸激酶在肿瘤发生发展和转移过程中的作用研究。但是,有关Syk仍有许多问题需要深入研究,如其在不同种属组织间的表达情况,抑制肿瘤细胞侵袭性生长的具体机制,是否可以作为检测乳腺癌等肿瘤的标记分子及临床应用价值等
[11]
[2]ZeoA.JenniferAPietenpolSyk:anewplayerinthefieldofpeastcancer
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。然而,用
于研究的Syk蛋白和抗Syk抗体尚未得以普及销售,我们从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化了Syk蛋白。在本研究中,我们将syk基因重组于昆虫细胞(Sf21细胞),从25亿个Sf21细胞中提取了225mg蛋白质。为了减少蛋白降解或活性丧失,迅速进行了层析分离。首先经Yellow-3层析柱分离,得到两个含有Syk蛋白的层析成分,两个成分分别在420~500mmol/L和550~650mmol/L的盐浓度梯度之间被洗脱。蛋白印迹分析显示,两个蛋白质峰均含有Syk蛋白(Mr为72 10)。将Yellow-3层析分离得到的两个Syk成分进一步用ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱纯化,得到两个纯的Syk成分,两种成分均在22~28层析成分中被分离出来,即Mr相同,与Syk的分子量吻合。该成分的NaCl洗脱液浓度为700~800mmol/L。经SDS-PAGE分离,蛋白印迹实验证实,Mr在72 103处的蛋白条带为Syk。但是,两种Syk经
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