泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建_去泛素化酶

　　摘要利用pEGFP-C3作为载体，构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1）序列的真核表达质粒，观察其在真核细胞中的表达和定位，为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA，双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后，在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实，已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞，观察到绿色荧光蛋白表达，还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中；而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞，绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因，构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。
　　关键词UFC1基因；克隆；真核表达载体
　　中图分类号Q78文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）08-0023-02
　　
　　ConstructionofFluorescenceExpressionVectorofUbiquitin-foldModifierConjugatingEnzyme（UFC1）Gene
　　HE Ai-lan 1PENG Dong-hai 1WU Xiao-ling 2LIAO Yan-yang 2 *
　　（1 Hunan Institute of Humanities，Loudi Hunan 417000； 2 Hunan Agricultural University）
　　AbstractTo construct eukaryotic expression plasmid of ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme（UFC1） gene linked with GFP gene with pEGFP-C3 vector and observe its expression and location in eukaryotic cells，thus it can provide a powerful tool to further studythe function of UFC1 gene.The full-length cDNA of UFC1 gene was amplified from human cervical carcinoma Hela cell by RT-PCR；UFC1 gene was cloned into eukaryotic expression vector pEGFP-C3 after double-digestion；To construct and identify the recombinant plasmid pEGFP-C3-UFC1. Then the plasmid was transfected into Hela cells by liposome，and its expression was detected by observing the expression of enhanced green fluorescent protein（EGFP）through fluorescent microscope. Recombinant pEGFP-C3-UFC1 vector was confirmed by double-digestion and sequencing. The green fluorescence was observed in transfected Hela cells. It was mostly located in the cytoplasm and distributed unequally with pEGFP-C3-UFC1 vector transfected；but it was located in cell whole and distributed equally with control vector pEGFP-C3 transfected. UFC1 gene was successfully cloned and recombinant pEGFP-C3-UFC1 vector was successfully constructed.
　　Key wordsUFC1 gene；clone；eukaryotic expression vector
　　
　　UFC1的全名为“ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1”，是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2[1-2]功能的基因。据目前所知，UFC1具有 Ufm1（ ubiquitin-fold modifier 1）结合酶的功能，其活性位点是半胱氨酸Cys116[3]。Ufm1（ubiquitin-fold modifier 1）是一种类泛素修饰因子，通过 Uba5（E1）和 UFC1（E2）共价结合到靶蛋白上。目前，国内外对UFC1其他功能的研究报道还比较少，有待更进一步的研究和探讨。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　真核表达质粒pEGFP-C3、大肠杆菌DH5α、人宫颈癌Hela细胞株由湖南人文科技学院实验室保存。
　　1. 2试验试剂
　　限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4-DNA连接酶等购自New England Biolabs公司；Taq聚合酶、DNA marker及琼脂糖等购自TaKaRa公司；PCR引物合成及测序由上海Sangon公司完成；凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自杭州新捷生物科技有限公司；RNA反转录试剂盒为promega公司产品；DMEM高糖培养基购自Gibco公司；新生小牛血清为杭州四季青公司产品；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒购于Invitrogen公司；其他常规试剂均为国产分析纯。
　　1.3试验方法
　　1.3.1RT-PCR扩增UFC1的cDNA序列。根据GenBank（NM_016406）登录的人UFC1基因序列及pEGFP-C3载体上的酶切位点，设计并合成1对引物U1（上游引物）和U2（下游引物），引物的5′端分别加上EcoRⅠ、SalⅠ限制性酶内切位点[4]。U1：5′-TTTGAATTCTGAAGATGGCGGATGAAGC CAC-3′（下划线为EcoRⅠ酶切位点）；U2：5′-TTTGTCGACC TCAGTGGCTTGATTCTTCATTGGTT-3′（下划线为SalⅠ酶切位点）。当Hela细胞长至90%，收集细胞，用PBS洗1次，800 rpm离心5 min，去上清液；根据Trizol方法，提取总RNA。取总RNA 5 μg，构成20 μL反应体系，按Promega的反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。得到cDNA后，以反转录产物2 μL为模板，以U1、U2为引物进行常规PCR扩增，总反应体积30 μL，扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察后，用凝胶回收试剂盒回收544 bp的DNA条带[4-6]。
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　　1.3.3pEGFP-C3-UFC1重组表达载体的转染。将Hela细胞培养于含双抗和10%新生牛血清的DMEM完全培养基中，当贴壁细胞单层生长达95%融合时，用胰蛋白酶消化传代，以每孔6万个细胞传代于24孔细胞培养板中，设3复孔。当细胞融合度达80%~90%时进行转染，转染前2 h更换成无血清无抗生素培养基，转染后4 h更换成一般培养基。按照Lipofectamine 2000说明书转染pEGFP-C3-UFC1和对照载体pEGFP-C3至Hela细胞中，转染24 h后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况[4]。
　　2结果与分析
　　2.1RT-PCR扩增UFC1的cDNA序列
　　以Hela细胞的RNA为模版进行cDNA的合成，再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得约500 bp DNA条带，与预期UFC1基因的PCR产物大小（544 bp）相符（图1）。
　　2.2PCR法筛选阳性克隆
　　以菌落上的少许菌体直接作为模板进行PCR扩增，经电泳分析发现，在筛选的5个菌落中，有4个菌落可见到544 bp大小的阳性条带（图2）[5]，与预期片断大小一致。因此，推测这4个克隆即为含有UFC1基因的阳性克隆。
　　2.3表达载体的双酶切鉴定及测序鉴定
　　选取阳性克隆提取质粒DNA，并进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定[5]，结果显示为约500 bp的条带和约4 kb的载体片断，其结果符合所构建质粒特征（图3）。经PCR及双酶切鉴定的pEGFP-C3-UFC1重组体的质粒送上海生物工程技术服务公司测序，测序结果表明，所克隆的UFC1序列与GenBank所报道的序列完全一致。
　　2.4pEGFP-C3-UFC1表达的检测
　　采用脂质体转染法，将对照载体pEGFP-C3和pEGFP-C3-UFC1质粒转染至Hela细胞，24 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果显示，2种质粒转染细胞均观察到绿色荧光（图4）：pEGFP-C3-UFC1质粒转染细胞的绿色荧光呈点状分布于细胞质中；而对照pEGFP-C3质粒转染细胞的绿色荧光则呈弥散状分布。
　　3讨论
　　近年来，肿瘤严重威胁人类健康[6]。肿瘤的浸润和转移是导致患者死亡的一个主要原因，浸润和转移是一个多基因参与、多步骤进行及多阶段发展的过程。随着分子生物学的快速发展，一种新途径引起关注，即泛素（ubiquitin）系统[7]。
　　泛素在20世纪70年代中期被发现，随后与泛素类似的小蛋白家族，称泛素样蛋白（ubiquitin-like proteins，UBLs）被报道，并且新成员不断增加。Ufm1是泛素样蛋白家族的新成员，通过Uba5（E1）和UFC1（E2）共价结合到靶蛋白上[1]。在人类的基因组中，有12个多E2家族基因。其中，UFC1就是一种E2类似酶，特异性地作用于Ufm1。UFC1与其他的E2结合酶没有明显的序列同源性。UFC1在泛素系统中的作用越来越引起人们的重视，但对于UFC1的其他功能研究报道还比较少，特别是UFC1在恶性肿瘤发生和发展中的作用机制的研究还未见报道，有待更进一步的研究和探讨，这是一项全新而有意义的工作。
　　该试验克隆了UFC1基因的cDNA编码区序列，构建了pEGFP-C3-UFC1真核表达载体，并能在真核细胞中表达，为进一步的体内研究创造条件，并为研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。
　　4参考文献
　　[1] KOMATSU M，CHIBA T，TATSUMI K，et al.A novel protein-conjugating system for Ufm1，a ubiquitin-fold modifier[J].Embo J，2004，23（9）：1977-1986.
　　[2] LIU G，ARAMINI J，ATREYA H S，et al.GFT NMR based resonance assignment for the 21 kDa human protein UFC1[J].J Biomol NMR，2005， 32（3）：261.
　　[3] MIZUSHIMA T，TATSUMI K，OZAKI Y，et al.Crystal structure of Ufc1，the Ufm1-conjugating enzyme[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，362（4）：1079-1084.
　　[4] 郭荫广，陈全，朱大冕.糖基化磷脂酰肌醇锚定型EGFP真核表达质粒的构建及表达[J].生物技术通报，2009（11）：89-91，97.
　　[5] 曲珊珊，王洋，张海英，等.高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定[J].吉林大学学报：医学版，2009（6）：975-978.
　　[6] 郭荫广，陈全，郑毅，等.肿瘤特异性锚定型α-gal模拟表位真核表达质粒的构建及功能研究[J].免疫学杂志，2010（9）：781-784，788.
　　[7] HERSHKO A.Ubiquitin-mediated protein degradation[J].J Biol Chem，1988，263（30）：15237-15240.
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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