姬松茸的功效与禁忌 姬松茸蛋白制备及分析研究
摘要以姬松茸子实体为原料，对姬松茸蛋白的制备工艺进行研究。用碱提酸沉法和酶法，采用4因素3水平L9（34）正交试验确定最佳提取方法和提取工艺；用SDS-PAGE测定蛋白质亚基分子质量分布。结果表明，碱提酸沉法提取的最佳条件为：提取温度30 ℃，pH值9.5，料液比1∶20，时间1.5 h，提取率达26.80%；酶法提取蛋白质的最佳条件为：提取温度40 ℃，1%的酶液0.6 mL，料液比1∶20，时间2.0 h，提取率达32.74%。酶法优于碱提酸沉法。姬松茸蛋白质等电点为3.25，主要蛋白质亚基的分子量为81.7 kD。
关键词姬松茸；蛋白质；制备；碱提酸沉法；酶法
中图分类号TS201.2文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）03-0349-02
StudyonPreperationandAnalysisofAgaricusblazeiMurillProtein
WANG Zhen 1CHANG Ding-ran 2CHANG Ming-chang 1SUN Chun-you 1ZHANG Qiong-yu 1FENG Cui-ping 1 *
（1 School of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801； 2 College of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University）
AbstractAgaricus blazei Murill was chosen as the raw material，protein preparation process was studied. Alkali extraction & acid precipitation and enzyme digestion were used for Agaricus blazei proteins extraction，the optimal extraction processing was determined by 4 factors and 3 levels orthogonal test. The subunit molecular weight distribution of extracted protein was analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the optimal extraction condition of alkaline extraction & acid precipitation is at 30 ℃，pH valne 9.5，solid-liquid ratio 1∶20，for 1.5 hours. The extraction rate reached 26.80%. The optimal extraction condition of enzyme digestion is 40 ℃，0.6 mL enzyme of 1%，solid-liquid ratio 1∶20，for 2.0 hours. The extraction rate reached 32.74%. The isoelectric point of Agaricus blazei is 3.25，and the molecular weight of major protein subunit is 81.7 kD.
Key wordsAgaricus blazei；protein；preperation；alkaline extraction & acid precipitation；enzyme digestion
据报道，每100 g姬松茸干品含粗蛋白40.50 g，可溶性糖类38.45 g，粗纤维6～8 g，脂肪3.4 g，灰分5.7 g，是一种含糖质、蛋白质丰富的食用菌[1-2]。目前，对姬松茸的研究大都集中在多糖的研究上[3-5]，姬松茸提取多糖后，下脚料中还含有大量的蛋白质。刘萍[6]采用发酵法，从菌丝体中提取蛋白质，动物试验证明具有显著的抑癌作用。本试验以姬松茸子实体为原料，对碱提酸沉法和酶法提取姬松茸蛋白质的工艺进行研究，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子量，从而为姬松茸蛋白质和多肽的进一步研究和开发提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料：姬松茸（A. blazei）子实体，由山西农业大学食用菌中心提供。主要试剂：蛋白质marker（6.5-200 kD），由宝生物工程（大连）有限公司提供；Sephadex G-100、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED），由美国Sigma公司提供；木瓜蛋白酶由北京索莱宝科技有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验设计
1.2.1碱提酸沉法提取蛋白质最佳工艺条件的确定。在单因素试验基础上，碱提酸沉法以pH值、料液比、温度、时间为因素，采用4因素3水平L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺条件。因素水平见表1。
1.2.2酶法提取蛋白质最佳工艺条件的确定。在单因素试验基础上，酶法提取以加酶量、料液比、温度、时间为因素，采用4因素3水平L9（34）正交试验。确定最佳提取工艺条件。因素水平见表2。
1.3试验方法
1.3.1等电点的确定。取等量的碱提离心液调pH值至不同值，根据离心所得沉淀量确定等电点pI值。
1.3.2姬松茸蛋白质提取。将姬松茸子实体于45～50 ℃烘干粉碎后过100目筛，备用。称取姬松茸粉，在一定条件下浸提，4 000 r/min离心15 min，取上清液，用0.1 moL/L的盐酸调pH值至等电点，静置1 h，4 000 r/min离心10 min，得蛋白质沉淀，加一定量蒸馏水溶解蛋白质，然后用0.01 moL/L的NaOH溶液中和至pH值7.0，冷冻干燥，得姬松茸蛋白粉。
1.3.3蛋白质的纯化及测定。用Sephadex G-100凝胶进行纯化；参照GB5497-1985，用凯氏定氮法测定蛋白质含量；用SDS-PAGE测姬松茸蛋白质分子量[7]。
2结果与分析
2.1等电点的确定
由图1可知，姬松茸蛋白质的等电点pI值为3.25。
2.2姬松茸蛋白质提取工艺条件确定
2.2.1碱提酸沉法最佳提取条件的确定。正交试验结果见表3。经极差分析可知，RC＞RA＞RB＞RD，因此影响提取量大小的因素依次为：C＞A＞B＞D，即温度＞pH值＞料液比＞提取时间。方差分析结果表明，温度、pH值、料液比对提取量影响差异显著，提取时间对提取量影响差异不显著。提取蛋白质的最佳条件为A2B2C2D2，即pH值9.5，料液比1∶20，温度30 ℃，提取时间1.5 h。经验证试验，该处理条件下提取率为26.80%，确为最优组合。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 2.2.2酶法最佳提取条件的确定。正交试验结果见表4。由极差分析可知，4个因素极差大小顺序为：RC＞RA＞RD＞RB，即影响酶法提取工艺的最主要因素是温度，酶用量次之，料液比和提取时间影响较小。方差分析结果表明，温度、酶用量对试验结果影响极显著（P＜0.01），料液比、时间对试验结果影响不显著。最优提取条件为A2B2C2D3，即加酶量为1%的酶液0.6 mL，料液比为1∶20，温度为40 ℃，提取时间为2.0 h。经验证试验，该处理条件下提取率为32.74%，确为最优组合。
2.2.3两种工艺条件比较。比较2种工艺条件，酶法提取蛋白的提取率较高，优于碱提酸沉法。
2.3蛋白质含量与蛋白质分子量的测定
经凯氏定氮法测得姬松茸子实体中蛋白质含量为38.48%，与常明昌[1]的研究报道基本一致，提取所得姬松茸蛋白质含量为61.19%，纯化后蛋白质含量为89.47%。样品蛋白质浓度10 mg/mL，用13%浓度的分离胶，通过SDS-PAGE分析姬松茸蛋白亚基分子质量，采用天能凝胶成像系统分析软件分析，结果见图2。主要蛋白质分子量为81.7 kD。
3结论
试验结果表明，碱提酸沉法提取蛋白质最佳条件为：温度30 ℃，pH值9.5，料液比1∶20，提取时间1.5 h；酶法提取最佳条件为：提取温度40 ℃，加酶量为1%的酶液0.6 mL，料液比1∶20，提取时间2.0 h。酶法提取效果优于碱提酸沉法。姬松茸蛋白质等电点为3.25，主要蛋白质分子量为81.7 kD。
4参考文献
[1] 常明昌.食用菌栽培学[M].北京：中国农业出版社，2003.
[2] 李青.姬松茸化学成分及药理作用研究现状[J].重庆中草药研究，2007，6（5）：40-43.
[3] 贾薇，郭倩，周昌艳.姬松茸多糖提取方法初探[J].食用菌学报，2001，8（1）：43-45.
[4] 曾小龙，廖新梅.姬松茸多糖化学组分及其药理作用的研究进展[J].中国食用菌，2007，26（1）：3-6.
[5] 吕喜茹，郭亮，李振，等.姬松茸多糖抗氧化作用[J].食用菌学报，2010，17（1）：69-71.
[6] 刘萍.姬松茸菌丝体蛋白MTSGTS1抗癌活性及作用机理的研究[J].药物生物技术，2001，8（5）：284-287.
[7] 陈雅惠.生物化学实验原理和方法[M].2版.北京：北京大学出版社，2005.
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