[关于近年江苏高考试卷中基因工程题目的思考] 基因工程靶向细胞疗法

　　基因工程操作程序主要包括4个步骤：目的基因的获取、基因的表达与载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。重组DNA技术(获取目的基因和基因的表达与载体的构建)是整个工程的核心技术。这一技术涉及许多相关知识：如DNA的结构、DNA的复制、限制性内切酶和DNA连接酶及DNA聚合酶的作用与特性、基因的表达、载体的组成结构与作用等。同时也要具备许多相关操作能力，如PER技术、限制性内切酶切割DNA的技术、DNA连接技术等。因此，高考命题者可以从不同的角度设置多种考题，考查考生对在这一系列知识点整体掌握程度及其相关能力。
　　2008－2010年高考生物江苏卷中连续出现了三道基因工程方面的大题，它们是2008年的第32题(8分)、2009年的第34题(7分)、2010年的第27题(8分)。2011年的第33题(8分)。下面以这几道题目为例深度分析该类试题易考知识点及几点思考。
　　1　试题分析
　　2008年第32题主要考查了：PCR中使用的DNA聚合酶的最主要特点(耐高温)；PER中退火温度的设定与引物DNA的碱基种类的关系(G-E碱基对多，DNA结构稳定，退火温度高)；DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专业性要求(没有)；将目的基因导入植物细胞采用最多的是农杆菌；两种限制性内切酶切割重组质粒得到DNA片段的种类。
　　2009年第34题中第(1)(2)小题考查了两种不同的限制性内切酶切割目的基因和质粒后可得重组质粒的种类。第(3)小题考查目的基因导人质粒后对质粒结构和功能的影响(只能在特定位置，不能在质粒复制原点、启动子、终止子及抗生素抗性基因中)。第(4)～(6)小题分别考查了DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体问的特异性结合、转基因植物栽培种降低害虫种群抗性基因频率增长速度的措施等问题。
　　2010年第27题仍然考查了质粒DNA热稳定性与碱基种类的关系、酶切位点的选择(不能破坏质粒标记基因及目的基因)、DNA连接酶的作用、单酶切载体和目的基因自身环化的问题(这个问题比较新颖，需要一定的实践经验，考生一般是想不到的，要解决这个问题只有选择两种不同的限制性内切酶来切割目的基因和载体)、目的基因表达的检测与鉴定的具体操作方法(这个问题涉及到配制选择性培养基的问题，由于教科书中缺乏这方面的知识，考生一般无法作答)。
　　2011年第3题考查了利用PCR技术扩增目的基因的原理和用限制酶切割质粒产生的位点问题。这部份内容教材当中虽然有相关知识点但学生回答时必须对书本知识有深入的理解的应用。试题中所提出的PCR技术扩增目的基因时出现的问题，是在PCR技术扩增目的基因实际实际操作中经常发生的问题和必须解决的问题，可以说这个考点来源于实际生产或者实验，对于有实验或实践经验的学生和老师解答起来没有问题，但是有多少学生做了PCR技术扩增目的基因这实验呢，出题者的意图是希望教材中应该做的实验应该让学生动手操作，让学生体会实验教程和解决实验过程中出现的问题。
　　以上列举了DNA重组工程的易考知识点和已考知识点，从易考知识点来看这类题目考查的方面很集中重复性也很强，但是从2010年的已考知识点来看这类题目的难度已经远远超出了课本的范围，对学生的实践经验要求很强(基因工程实验的学习应该是在大学课程中)，这对没有这方面经验的学生作答题目是很困难得。所以下面列举一些笔者能想到的未考查知识点。
　　2　对今后高考中考查基因工程内容的思考与展望
　　2.1　DNA连接酶的种类及作用
　　E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
　　2.2　受体细胞选择原核生物(特别是大肠杆菌)的原因
　　原核生物遗传背景简单、繁殖快、多为单细胞；而真核生物遗传背景复杂繁殖较慢，都是多细胞生物，所以经常选择原核生物作为受体细胞，且大肠杆菌是原核生物中遗传背景最简单的模式生物，自然是受体细胞的首选。
　　2.3　目的基因进入大肠杆菌的方法(除去Ca2+之外)
　　重组质粒导入受体细胞最常用的是Ca2+处理受体细胞，使受体细胞在温和的环境下能吸收周围环境中DNA分子。除了Ca2+处理受体细胞外，还可以用电转化的方法在高压环境下使受体细胞细胞膜的通透性增强，重组DNA分子就容易进入细胞。一般情况下电转化的效率要比ca2+转化高100多倍，如果要求获得高效率的重组DNA分子就要采用电转化的方法将目的基因导入受体细胞。
　　2.4　检验自我复制的质粒导入受体细胞(主要是原核生物)后是否是重组的
　　2.4.1　如果自我复制的质粒连接的是带有标记基因(该标记基因与质粒上的标记基因不同)的目的基因
　　比如质粒上带有抗氨苄青霉素基因(ampr)，目的基因带有卡那霉素基因(kanr)，检验自我复制的质粒导入受体细胞后是否是重组的，只要将受体菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上培养，能正常生长出来的菌株都是含有重组的质粒，没有重组的质粒在卡那霉素的培养基上是不能生长的。
　　2.4.2　如果自我复制的质粒连接的是没有标记基因的目的基因
　　如果质粒(比如带有抗氨苄青霉素基因)和目的基因(没有标记基因)都是单个限制性内切酶切割的，会出现载体自身环化和重组类型两种质粒(如果是双酶切一般都是重组质粒)含有这两种质粒的受体菌株都可以在氨苄青霉素的培养基上生长。所以还要进一步检测：对能正常生长的菌株进行质粒的提取，用未连接目的基因的原始质粒对照，将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，比原始质粒大的就是重组质粒。可以用之前的限制性内切酶切割该质粒，进一步确定是重组质粒。如果是双酶切一般都是重组质粒，为了进一步确定也可以进行如上的检验方法。
　　这些知识点列举肯定不尽全面，只是增长学生对基因工程多一些理解，补充一些在基因工程实验中易出现的问题及解决的方法而已，希望对解决该类题目起到一定作用。