[小Ｇ蛋白Ａｒｆ的研究进展]G蛋白偶联受体的研究进展

　　摘要小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关，进化相当保守，它是近些年信号转导方面研究的热点。有关Arf GTPase及其编码基因的研究工作报道很少，对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。主要阐述小G蛋白Arf在动植物及酵母中的研究进展，旨在揭示小G蛋白Arf作为“分子开关”具有重要的细胞生理作用。
　　关键词小G蛋白；Arf；信号转导
　　
　　G蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个GTP结合蛋白家族，根据其亚基组成及分子量大小，可将参与细胞信号转导的G蛋白分为异三聚体G蛋白（heterotrimeric G protein）、小G蛋白（small GTPase）和几种特殊的GTP结合蛋白[1]。小G蛋白是一类由超过100个成员所组成的蛋白超级家族，分子量较小，约为21～30kd，是区别于异三聚体G蛋白的单体鸟核苷酸结合蛋白。小G蛋白在结构和功能方面具有明显的多样性，真核生物利用这类蛋白形式的多样性和其不同鸟核苷酸结合态，调控着细胞许多重要的生理过程[2]。小G蛋白调控细胞功能是通过起始或终止某一特定的细胞功能来实现的，也即它们的活性决定了某一特定细胞功能持续的时间，因而小G蛋白通常又被称为细胞内的生物计时器（biological timers）。不仅如此，该蛋白还在某些蛋白质的定位（localizing）中起到至关重要的作用。近年来，人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员，也不断揭示小G蛋白的新功能，许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的“分子开关”来完成。
　　腺苷酸核糖基化因子（ADP-ribosylation factor，Arfs）是属于小G蛋白超级家族中的Arf亚族，在真核生物中普遍存在并高度保守。最初被发现是由于它可以激活霍乱毒素的ADP-核糖基转移酶活性[3]，并且人类和植物的Arf1基因均可互补于酵母Arf1突变株[4]。
　　Arl GTPase是类Arf GTPase，它与Arf有40%~60%同源性，但不能激活霍乱毒素，也不能回复Arf酵母突变体[5]。现在将这两个亚家族都归为Arf GTPase[3]。拟南芥基因组含有21个Arf GTPase家族成员，包括Arf和Arl亚家族成员。
　　
　　1小G蛋白Arf的结构与调解机制
　　
　　小G蛋白Arf家族成员之间具有一些特有的保守区域G1（GLDAAGKT），G2（NKQDL）和G3（DVGGQ）。G1区是P-loop结构，负责与磷酸基团相互作用，G2区是结合特异的鸟核苷酸，G3区与核苷酸基团相互作用，这些结合区域具有GTP结合蛋白的功能。我们通过香蕉Arf氨基酸序列的生物信息学分析发现，Arf家族在植物中的进化相当保守。香蕉的Arf氨基酸序列中除含有G1、G2、G3区外，还带有1个N-糖基化位点，2个蛋白激酶C磷酸化位点，2个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个N－豆蔻酰化位点，1个微体C端靶信号，1个ADP核糖化因子信号。这些活性位点的功能基本都与膜质运输和维持细胞器完整性有着十分密切的关系。
　　与其他小G蛋白一样，Arf小G蛋白对上下游的调控机制与异三聚体G蛋白不同，其“分子开关”是依靠它的附属蛋白调控的，称之为鸟核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEFs），它可以催化Arf转换为GTP结合形式，即活化态，当Arf蛋白处于活化态时，就可以和不同的下游效应器分子相互作用，进而执行不同的细胞生理功能。Arf蛋白的非活化态的形成有两种方式：一种是它自身的水解能力即GTPase活性可以把GTP水解成GDP+Pi；一种是通过它的另一附属蛋白来完成，称为GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein，GAPS），它可以激活小G蛋白的水解活性。通过上面所述的GTP水解过程，Arf蛋白转换为非活化态形式，开始了又一周期的循环过程[6]（见图1）。Arf小G蛋白复合体的这种调节方式和生理作用在所有有机体包括植物中保守存在，尽管小G蛋白的分子量很小，但是它通过与各种调控因子及效应器的相互作用在生物体各种生命活动中发挥了极其重要的作用。
　　
　　2Arf家族的研究现状
　　
　　2.1Arf GTPase
　　Arf GTPase在真核生物细胞的膜转运中起着重要的作用[7]。Arf GTPase可参与形成胞质溶性外被蛋白并将其运送到囊泡出芽位点。运输囊泡的外被蛋白有三种类型：COPI、COPII和笼形蛋白，它们的形成都与Arf家族密切相关。人们在酵母中已经深入研究了Arf GTPase的一个亚家族Sar1p参与形成COPII外被蛋白转运囊泡的机理[8]。拟南芥中有3个Sarlp同源序列，命名为AtSAR1a-c。AtSAR1a-c可以回复相应的酵母突变体，其表达水平与植物细胞内质网膜的分泌活性有关，一旦内质网的物质转运被阻断，会导致AtSAR1a mRNA水平的升高[9]。酵母的Arf1p和Arf2p负责COPI笼形蛋白从顺面高尔基体到内质网的囊泡运输[10]。拟南芥中有12个Arf GTPase同源序列，其中有6个AtArf GTPase与人类Arf1、与Atγ-COP（拟南芥COP-I笼形蛋白复合体同源序列）共同定位于外周高尔基体。近年来研究发现，小G蛋白Arf作为磷脂酶D（PLD）的活化因子，激活磷脂酶D和磷脂酞肌醇四磷酸激酶，抑制arf1―arf2―致死突变等。哺乳动物的Arf还存在于高尔基体复合物中，通过与GTP结合成活化态的方式，改变膜脂成分，并影响膜表面蛋白，虽然其初始状态并不清楚，但是可促使高尔基体小囊泡在细胞质中的形成。因此，担负着高尔基体的形成、结构及跨膜物质运输等重要功能[11，12]。同时Arf对于内质网―高尔基系统的形成也起一定的作用：它把细胞质中的蛋白转运到内质网中补充膜表面蛋白的损失[7]。此外，Arf可能通过转录后的自我修饰在DNA的切除修复中起重要作用[13-15]。
　　在酵母中对Arf1基因进行突变，结果出现了对低温敏感、生长缓慢、对氟敏感、多种分泌突变等表型。对胡萝卜种子进行乙烯与各种胁迫处理，从表达分析结果看，Arf1基因对乙烯敏感，对胁迫不敏感[16]。在小麦中克隆得到Arf1基因，低温处理小麦各个组织，结果发现小麦Arf基因对低温胁迫并不敏感。对拟南芥中的根毛发育研究发现：Arf在洋葱和拟南芥细胞中都定位在高尔基体和内质网；Rop2和PIN1蛋白是在Arf作用的靶蛋白，且Arf在质膜和细胞质之间对生长素极性运输起到重要作用[17]。我们使用乙烯利和乙烯吸收剂对香蕉采后果实进行了不同处理，结果发现了Arf1在香蕉果实采后不同处理中呈差异表达，说明了Arf1在转录水平上参与了香蕉果实成熟的生理过程。
　　在 Arf基因的组织特异性研究结果发现，各个物种互不相同，如拟南芥中Arf基因在整个细胞生长周期都表达[18]，胡萝卜的Arf基因即使在胚胎体细胞发生时表达量也几乎没有变化；马铃薯[19]和小麦[20]的Arf基因虽然在整个生长周期都可以检侧到，但其表达都具有组织特异性，即在根中的表达要远远大于茎。鉴于Arf在小麦和马铃薯根中的特异表达，Uehara等推测其在高等植物的根中起着重要的作用。Wilczynski等将马铃薯的反义Arf转入马铃薯导致了退化根的生成[21]，也进一步证明了该基因在植物根中的重要性。但是从棉花陆地棉中分离到的Arf1 EST序列，通过RNA斑点杂交表明：Arf1表达具有组织特异性，主要在花冠、花粉、子房、花瓣等各种花器官中特异表达，在根、茎、叶不表达[22]。在陆地棉品种Y18中获得Arf1基因全长cDNA，Northern杂交结果表明，该基因在棉花的根、茎、叶表达很弱，而在蕾、花、纤维和铃壳中呈显著优势表达[23]。这和前人有关Arf基因组织特异性的研究结果有明显的不同，如Arf在马铃薯和小麦的根中起重要作用，但在棉花的Arf在棉花的根中却几乎不表达，而是在生殖器官中表达，并且棉花Arf不是在整个生长周期都表达[24]。在对香蕉不同器官的表达研究表明（见图2），香蕉Arf1的表达不具有组织特异性，在0d果实中的表达量最高，花中的较高，根茎中表达量接近，老叶中的表达量最低，说明MuArf1不仅参与营养器官的发育调控，而且参与整个生殖器官分化和发育的调控。
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　　2.2Arl GTPase
　　拟南芥中有6个Ar1 GTPase，尽管人们对一个果蝇Ar1 GTPase做了一些重要的功能研究[25]，但人们对Ar1 GTPase的功能还了解太少。植物中，与AtARLCl同源的TITAN5基因突变后，导致种子发育中有丝分裂过程和细胞周期的明显改变，也许这是因为此基因在胚胎发育正确形成细胞板的膜转运过程中起着重要作用[26]。
　　
　　3展望
　　
　　从这些研究结果可以看出小G蛋白Arf在生物中是重要的多功能调控分子，有许多试验表明植物的Arf可能与相应的动物和酵母蛋白起着相同的生理作用。除此之外，小G蛋白的GAP和GEF蛋白的发现，也进一步证实在真核生物进化中小G蛋白调控分子的高度保守性。但是，植物在这些保守的调控机制方面还是存在一些多样性。
　　目前，关于植物Arf GTPase功能的研究还处于初级阶段，利用对突变体研究揭示了Arf GTPase功能的多样性，酵母双杂交技术的应用使我们对Arf的靶物有了初步的了解。但在Arf调控信号转导中还有许多问题亟待解决。如特定Arf的作用位点，不同的Arf在细胞和亚细胞水平的定位以及Arf是如何与不同的调控子和效应子相互作用的，Arf激活的分子机制、Arf是怎样通过调控下游因子来调控特定的生理过程等这些都需要进行生物化学、细胞生物学和遗传学等方面的分析，这些方法的综合利用最终应该能揭示Arf的作用机制及激活机制，从而揭示小G蛋白功能的多样性。
　　
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