植物愈伤组织的诱导 [金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比]

　　摘要：以金线兰根状茎、幼茎、叶片、离体胚为外植体，４种激素２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ采用Ｌ９（３４）正交表处理，对愈伤组织诱导的条件进行研究。结果表明，６－ＢＡ和２，４－Ｄ在诱导金线兰愈伤组织中作用极为显著，４种激素对愈伤组织的诱导作用大小依次为，６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ，初步断定金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比是０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ；根状茎和幼茎作为外植体更易诱导愈伤组织形成；暗培养较光暗交替更易诱导愈伤组织生长。
　　关键词：金线兰；愈伤组织；诱导；条件
　　中图分类号：Ｓ６８２．３１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2568-03
　　
　　Study on the Optimum Hormone Ratio Inducing Callus of Anoectochilus roxburghii
　　
　　ＬＩＮ Ｈａｉ，ＨＡＯ Ｈｕｉ－ｍｉｎ
　　（Ｒｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｅｂｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，Ｈｅｂｉ ４５８０３０，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｍｅ， ｌｅａｆ ｂｌａｄｅ， ｓｔｅａｍ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ， ２，４－Ｄ， ６－ＢＡ， ＮＡＡ ａｎｄ ＺＴ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ６－ＢＡ ａｎｄ ２，４－Ｄ ｐｌａｙｅｄ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ． Ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｗａｓ ６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｉ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｗａｓ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ． Ｉｎｄｕｃｉｎｇｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｗａｓ ｅａｓｉｅｒ； ａｎｄ ｃａｌｌｕｓ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ； ｃａｌｌｕｓ； inducement； ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
　　
　　金线兰［Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ（Ｗａｌｌ．）Ｌｉｎｄｌ．］，兰科开唇兰属植物，全草入药，味甘、性平，具有清热凉血、除湿解毒的功效，可治疗肺结核、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症，是民间珍稀名贵的中草药［１］。除药用外，由于株型矮小，叶型优美，叶面黑紫色，有金黄色带有绢丝光泽的美丽网脉，是观赏价值极高的室内观叶珍品，具有广阔的开发利用前景。
　　金线兰种子自然条件下萌发率很低，再加上过度采集，野生资源日益枯竭［２］。在人工培养条件下诱导愈伤组织生长并使其增殖是实现快繁和分离其次生代谢产物获取金线兰药用成分的重要途径，但目前罕见金线兰愈伤组织诱导的研究报道。采用正交试验研究了４种激素对诱导愈伤组织生长的影响，为金线兰愈伤组织诱导和细胞培养体系的建立提供依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　外植体：于花卉市场采购金线兰植株。
　　金线兰离体胚：于市场采购金线兰种子，清水浸泡２４ ｈ，剥取离体胚。
　　１．２方法
　　１．２．１培养基及外植体的消毒与接种培养基：ＭＳ基本培养基＋３0．０ g/L蔗糖＋８.0 g/L琼脂，附加不同浓度的２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ，ｐＨ值为５．８～６．０，每１５０ ｍＬ三角瓶中加培养基３０～４０ ｍＬ，灭菌２０ ｍｉｎ，双层牛皮纸封口，灭菌后１～２ ｄ备用。外植体消毒：在超洁净工作台上进行操作，将金线兰芽的尖端部分、幼嫩的根状茎、新生叶片用清水冲洗干净后，再用去离子水冲洗５次，用体积分数为７５％的酒精浸泡３０ ｓ后再用无菌水冲洗３次，０．１ g/100mL的ＨｇＣｌ２浸泡８～１０ ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３次，即完成消毒。接种：消毒后的材料置于无菌滤纸上吸干水分，然后将材料切割成适量大小接种到加有不同浓度激素的培养基中。
　　１．２．２试验处理根状茎处理：基本培养基为ＭＳ＋３0．０ g/L蔗糖＋８.0 g/L琼脂，激素选取２，４－Ｄ、６－ＢＡ，激素处理如表１。每种激素处理接种１２瓶，６瓶于光暗交替下培养；６瓶于暗处培养。光暗交替培养放在日光灯照明的培养架上，每天８∶００－１８∶００照明，温度设置为２０ ℃恒温培养；暗处培养的放在２０ ℃培养箱中培养，湿度为８５％～９０％。每隔１０ ｄ观察记录每种处理外植体的变化，并对发生变化的外植体进行数码拍照。
　　幼茎、叶片及离体胚处理：基本培养基为ＭＳ＋３0．０ g/L蔗糖＋8.0 g/L琼脂，选取２，４－Ｄ、ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＺＴ ４种激素处理，每种激素取３个水平，利用Ｌ９（３４）正交表，考察４种激素对金线兰愈伤组织诱导的影响，激素处理见表２。每种处理接种６瓶，离体胚每种处理接种２瓶，暗处２０℃培养，湿度为８５％～９０％。每隔１０ ｄ观察外植体变化并记录。
　　２结果与分析
　　２．１对根状茎诱导愈伤组织结果进行观察并分期照相
　　光暗交替下的金线兰愈伤组织生长的较疏松，为绿色团块状，而暗处理下金线兰愈伤组织较紧密，白色或略带黄色。光暗交替培养，①处理在第６０天时有新的须根出现，７０ ｄ时须根下面生成不规则突起，８０ ｄ时变成类似芽状的组织，９０ ｄ时生成花蕾样突起；③处理在８０ ｄ时才有新根出现，９０ ｄ时须根变长；④处理外植体表面在２０ ｄ时有短细毛出现，９０ ｄ时表皮开裂（图１、２）；⑧处理在９０ ｄ时下部生成一突起。暗处培养的金线兰，①处理在４５ ｄ时有须根出现，５５ ｄ时出现芽状体，６５ ｄ时出现不规则突起；④处理直到６５ ｄ时都没有什么变化。其他处理则因染菌外植体全部死亡。
　　金线兰根状茎诱导愈伤组织生长的基本情况，金线兰茎在１０ ｄ左右切口便可观察到白色致密的颗粒状愈伤组织，３０ ｄ时愈伤组织生长达到最大速度。低浓度处理的金线兰外植体在暗处培养４５ ｄ时出现须根，６５ ｄ左右出现芽状体，光暗交替培养的条件下６０ ｄ出现须根，８０ ｄ左右才出现芽状体。因此金线兰根状茎诱导愈伤组织生长在暗培养条件较光暗交替条件好。
　　２．２不同激素处理对金线兰叶片愈伤组织的诱导
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　　２．３不同激素处理对金线兰离体胚愈伤组织的诱导
　　接种１０ ｄ后离体胚看不出变化，３０ ｄ时可观察到部分处理中离体胚膨胀伸长，但不明显。
　　２．４不同激素处理对金线兰幼茎愈伤组织的诱导
　　接种１０ ｄ后金线兰幼茎切口处出现白色点状物质，２０ ｄ后白色点状物质逐渐扩大，形成一层薄薄的愈伤组织，３０ ｄ后统计各处理诱导愈伤组织的数目。
　　通过６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＮＡＡ、ＺＴ ４种激素３个水平９个浓度组合的正交试验发现各种组合对金线兰愈伤组织诱导的影响差异很大，通过对试验结果进行极差分析［３］， ４种激素对愈伤组织的诱导作用大小依次为６－ＢＡ＞２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＺＴ。金线兰愈伤组织最佳激素配比可初步断定为０．２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．９ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＺＴ，且该结果和试验中处理组③诱导率最大基本吻合（表３）。但因试验各处理的重复中愈伤组织诱导率差异较大，故而试验的可行性较差，最佳激素配比仍需进一步试验验证，由表可以看出６－ＢＡ、２，４－Ｄ为金线兰愈伤组织诱导的主要因素，是否６－ＢＡ、２，４－Ｄ两者的组合更适合诱导金线兰愈伤组织尚需进一步试验。
　　２．５外植体大小对愈伤组织诱导的影响
　　以金线兰幼茎为外植体，当茎直径小于０．５ ｃｍ时，从接种第七天开始，茎两端切口处渐渐变黄，随着时间的延长，色泽逐渐加深，２０ ｄ时变成深褐色，且部分外植体切口分泌出淡黄色液体，３０ ｄ时部分幼茎渐渐发黑死掉。当外植体茎直径大于０．５ ｃｍ时，接种１０ ｄ开始在切口处愈伤组织以点状出现，１５ ｄ时已能看到薄薄的一层白色结晶状物质，３０ ｄ时，形成白色较致密的愈伤组织。吕玉虎等［４］研究认为外植体在培养基上的不同放置方式对百合鳞片愈伤组织诱导也有影响，其诱导出芽能力从强到弱依次为：鳞片内侧向上＞鳞片竖直插入＞鳞片内侧向下平放。金线兰外植体的放置方式是否影响到愈伤组织的生长还需进一步研究。在试验中，金线兰茎水平放置和垂直放置（一切口接触培养基）两者的愈伤组织生长情况有明显的差别，垂直放置生成愈伤组织的量多且愈伤组织较致密、生长旺盛，水平放置愈伤组织生成量少、疏松且生长较慢。
　　３讨论
　　１）在试验过程中外植体或愈伤组织发生褐化现象，其原因是多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白质时形成深色化合物，这些物质很快又被氧化和形成复杂的醌类物质，从而导致外植体组织或细胞逐渐变成褐色或黑色，最后死亡［５，６］。据报道，加入抗氧化剂或吸附剂对抑制褐化有明显的效果，在试验中通常采用ＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）和活性炭抑制褐变［７，８］。表３可看出金线兰愈伤组织褐化率比较高，这是因为培养基中没有加入抑制剂。
　　２）根据细胞全能性理论，植物任何器官都可以用作外植体，但不同组织器官培养成功的难易程度是不同的，同一种植物不同的组织和器官再生能力也有很大差异［９］。试验中取根状茎、幼茎、叶片、离体胚为外植体，结果表明，只有根状茎和幼茎易产生愈伤组织，愈伤组织布满切口或外侧、质地紧密、时间相对短，且诱导率较高。离体胚愈伤组织形成不明显。叶片在消毒时被杀死，无愈伤组织生成。根状茎、幼茎和离体胚诱导愈伤组织能力不同证明不同器官和组织的再生能力不同。
　　参考文献：
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　　［３］ 徐吉民． 正交法在医药科研中的应用［Ｍ］． 北京：医药科学技术出版社，１９８７． ３６．
　　［４］ 吕玉虎，李彬青， 吴淑平， 等． 百合的离体组织培养和快速繁殖［Ｊ］． 信阳农业高等专科学校学报，２００２，１２（２）：１９－２０．
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　　［８］ 薛建平，柳俊，蒋细旺． 药用植物生物技术［Ｍ］． 合肥：中国科学技术大学出版社，２００５．３．
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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