S-D序列 三种簇角飞虱属昆虫１６,Ｓ,ｒＤＮＡ序列及系统进化研究
摘要：通过ＰＣＲ扩增获得了飞虱科３属５种昆虫的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列，对ＤＮＡ序列进行测定，分析了其序列组成及变异。采用Ｍｅｇａ ４．０软件，利用邻接法（ＮＪ）和最大简约法（ＭＰ）进行５种飞虱的系统发育分析，结果显示构建的ＭＰ和ＮＪ分子系统树拓扑结构一致，３个簇角飞虱属物种中华簇角飞虱（Ｂｅｌｏｃｅｒａ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐额簇角飞虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飞虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ）单独聚为一支，与偏角飞虱属海南偏角飞虱（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）的亲缘关系较近，与短头飞虱属显脊短头飞虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）的亲缘关系较远，分子生物学分析结果与形态学研究结果一致。
关键词：飞虱科；簇角飞虱属（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）；１６ Ｓ ｒＤＮＡ；系统发育
中图分类号：Ｑ９６９．３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3355-03
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ １６ Ｓ ｒＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｘｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１
（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ５ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒｓ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ３ ｇｅｎｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ（ＭＰ） ａｎｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（ＮＪ） ｕｓｉｎｇ Ｍｅｇａ ４．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｐｏｌｏｇies ｏｆ ＭＰ ｔｒｅｅ ａｎｄ ＮＪ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗere ｔｈｅ ｓａｍｅ． Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｉｎｅｎｓｉｓ， Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ ａｎｄ Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｃｌｏｓｅｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ ｗｈｉｌｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔa． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｗｉｔｈ ｔｈose ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ； Ｂｅｌｏｃｅｒａ； １６ Ｓ ｒＤＮＡ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ
飞虱科（Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ）隶属于半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）蜡蝉总科（Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ）［１］。该科昆虫许多种类是重要的农林害虫，它们通过刺吸汁液、产卵或传播植物病毒病等方式为害水稻、玉米、芦苇、甘蔗、竹子等，给农林生产造成巨大损失［２］。其中簇角飞虱属（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）为外形比较独特的一个属，其触角矢状，严重危害竹类植物［２，３］。该属目前记录５种，均为东洋种，仅中国云南、贵州、海南、广东、台湾等地有分布记载［２，４，５］。与簇角飞虱属外形相似，同样具备矢状触角的偏角飞虱属（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ）也为害竹类植物，且与簇角飞虱属的分布极其相似［１，２，５］。为了更好地进行两近缘属的分类研究，选取飞虱科簇角飞虱属、偏角飞虱属及外类群短头飞虱属的５个物种，利用其１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列片段进行系统发育分析，探讨两属间及种间的分子进化关系，以期为实际生产中害虫的鉴定提供一定的科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
簇角飞虱属中华簇角飞虱（Ｂ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐额簇角飞虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飞虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ），偏角飞虱属海南偏角飞虱（Ｎ． ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）及短头飞虱属显脊短头飞虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ），采集地信息见表１，采样后保存于无水乙醇中备用［６］。
１．２ 基因组ＤＮＡ的提取
将保存于无水乙醇中的供试虫体研磨碎，采用柱式动物基因组ＤＮＡ抽提试剂盒提取总ＤＮＡ，测定浓度后调整为１～２ ｎｇ／μＬ，保存于－２０ ℃冰箱备用。
１．３ ＰＣＲ 扩增及产物检测
１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列的引物设计参照文献［６］的方法，引物序列为１６Ｓ－ＰＦ ５′－ＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴ ＣＡＡＡＡＡ
ＣＡＴ－３′；１６Ｓ－ＰＲ ５′－ＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡ－３′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，内含１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，
０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ，０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ引物，１．０ Ｕ Ｔａｑ酶以及１ μＬ ＤＮＡ模板。ＰＣＲ反应程序为：９５ ℃预变性７ ｍｉｎ；９５ ℃变性５０ ｓ，５０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小、纯度及含量。