[紫球藻抗菌蛋白的纯化及其部分性质研究]纯化后的物质是性质一样吗

　　摘要：紫球藻提取液经硫酸铵沉淀、ＨＡ柱层析后分离纯化出１种抗菌蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定，2个亚基的相对分子量为２１.0 ｋＤ与３０.0 ｋＤ；此抗菌蛋白对热敏感，氨基酸组成分析显示含有１７种氨基酸，含量较高的是谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。纯化的蛋白对产黄青霉有较强抑制作用，其抗真菌活性比抗细菌活性强。
　　关键词：紫球藻；抗菌蛋白；纯化；性质
　　中图分类号：Ｑ９４９．２９＋２．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－~1587-03
　　
　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Some Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
　　Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ
　　
　　ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｑｉｎｇ１，ＺＨＥＮＧ Ｙｉ２，ＬＩＮ Ｘｉｏｎｇ－ｐｉｎｇ３
　　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ３６３０００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｆｕｊｉａｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｉｔｙ， Ｆｕｚｈｏｕ ３５0108，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｉｎｇｄｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｄｅ ３５２１００， Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ＨＡ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔｗｏ ｂａｎｄｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２１ｋＤ ａｎｄ ３０ｋＤ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄs， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｇｌｕ， Ｇｌｙ ａｎｄ Ａｓｐ ｗａｓ ｈｉｇｈ respectively． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ． Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
　　
　　植物含有丰富的抗菌蛋白，有数百种之多，如萝卜［１］、尾穗苋［２］、银杏［３］和葫芦种子［４］中的抗菌蛋白以及几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂、核糖体失活蛋白等［５］，它们都有不同程度的抑菌作用。Ｍｅｌｏ等［６］报道沙菜（红藻类）的粗蛋白具有抗真菌作用及从墨角藻中提取的类凝集素能抑制大肠杆菌和脑膜炎双球菌生长；陈国强等［７］研究发现，３种大型海藻的粗蛋白对６种植物病原真菌的菌丝生长及孢子萌发具有不同程度的抑制效果，但目前对微藻抗菌蛋白的研究报道较少。
　　紫球藻（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ）是一种比较原始的单细胞红藻，具有独特的物理特征，在生长过程中能合成多种有较高经济价值的生物活性物质。前期的研究发现紫球藻的蛋白质提取物具有抗菌活性［８］。本试验对此抗菌蛋白进行了分离纯化，并测定了其部分性质，为进一步开展微藻资源的研究提供参考。
　　１材料和方法
　　１．１材料
　　试验藻种为紫球藻，引自中国科学院水生生物研究所，以ＫＯＣＨ培养基进行振荡培养，培养光照强度为３ ０００ μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ），光周期为１２ ｈ光照／１２ ｈ黑暗，培养温度为２５～３０℃，取对数期（培养１０ ｄ后）的培养物，离心洗涤，收集藻泥，４℃保存备用。菌种来自福建师范大学生命科学学院（６种细菌）和福建农林大学植物保护学院（６种真菌）。
　　１．２方法
　　１．２．１抗菌蛋白质的分离纯化将紫球藻泥悬浮于ｐＨ值为６．８的１０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中，反复冻融，结合超声波破碎，离心，取上清液，加入硫酸铵至饱和度为５５％，充分搅匀，置４℃冰箱保存１２ｈ后离心，收集沉淀并溶于少量的ＰＢＳ中，透析，离心，获上清液，即为紫球藻蛋白提取物，检测抗菌活性，获得抗菌蛋白粗品，４℃保存。
　　将适量浓缩后的抗菌蛋白粗提液上羟基磷灰石（ＨＡ）柱层析，用ｐＨ值为６．８的１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ预平衡ＨＡ（１．８ｃｍ×３０ｃｍ层析柱），上样量２ ｍＬ，以离子强度不断增加的ＰＢＳ（分别为１、５、５０、１００、２００ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值为６．８并加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）洗脱，洗脱速度为２０ ｍＬ／ｈ，样品４ ｍＬ／管，分部收集洗脱液，测定２８０ ｎｍ的吸光度（Ａ），待Ａ２８０＜０．０１时换洗脱液。以考马斯亮蓝染色法（ＣＢＢ－Ｇ２５０）测定蛋白质浓度，用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）测定纯度，在室温下用日立Ｕ－３４００紫外分光光度计测定其吸收光谱［９］。
　　１．２．２测定蛋白质亚基分子量参考Ｌａｅｍｍｌｉ的方法［１０］，采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）测定蛋白质亚基分子量，分离胶浓度为１２％，浓缩胶浓度为３．９％。
　　１．２．３氨基酸组成分析取纯品１ ｍｇ，加入６ ｍｏｌ／Ｌ盐酸，至安瓿瓶中１２０℃水解６ ｈ，用去离子水反复冲洗去除盐酸，采用日立８３５－５０型氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成。
　　１．２．４抑菌活性的测定纯化后的蛋白质，配制成１０ ｍｇ／ｍＬ的溶液，参照文献［１１］，采用圆形纸片法测定其抑菌活性，观察结果并测量抑菌圈直径的大小。各个步骤均按无菌条件操作，每个样品设２个平行样，取平均值。
　　１．２．５热稳定性分析纯化的抗菌蛋白质（１０ ｍｇ／ｍＬ）分别置于５０～１００℃处理３０ ｍｉｎ，每１０℃ １个温差，以最敏感菌为指示菌，测定其抑菌活性。
　　２结果与分析
　　２．１抗菌蛋白的分离纯化
　　紫球藻蛋白提取液以ＨＡ柱层析，在洗脱过程中，随磷酸盐离子浓度的提高而逐渐出现一个鲜艳的粉红色洗脱峰（图１），收集此洗脱部分并透析浓缩，以产黄青霉为指示菌进行检测，具有抗菌活性，即为收集的抗菌蛋白。
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　　２．２抗菌蛋白的性质
　　２．２．１亚基分子量紫球藻抗菌蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示出2条带（图２），表明是由２个亚基组成，通过与标准蛋白的相对迁移率（Ｒｆ）比较，它们的分子量为２１.0 ｋＤ与３０.0 ｋＤ。
　　２．２．２氨基酸组成氨基酸测定结果见表１，可知除色氨酸全部被破坏未测出以外，紫球藻抗菌蛋白含有１７种氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，其次为天冬氨酸与甘氨酸含量，组氨酸与胱氨酸含量最少。
　　２．２．３抑菌活性从表２可以看出，纯化的紫球藻抗菌蛋白对６种真菌和４种细菌有抑制活性。对产黄青霉的抑制活性最为明显，对细菌的抑制不如对真菌的抑制作用强。紫球藻抗菌蛋白对各个真菌的抑制活性并不完全相同，这也与许多报道的抗菌蛋白性质相一致。
　　２．２．４热稳定性以产黄青霉为指示菌做抑菌试验，紫球藻抗菌蛋白在５０℃处理３０ ｍｉｎ后仍有抗菌活性，在６０℃处理３０ ｍｉｎ后抗菌活性消失，说明此抗菌蛋白对温度较为敏感。
　　３讨论
　　国内外研究人员已进行了大量关于植物抗真菌蛋白的研究，并从７０多种植物中发现了１７０余种具抗真菌功能的蛋白，这些蛋白对多种植物病原菌有抑制作用，是植物防御体系的重要组成部分［１２］。本试验所得蛋白质对供试的动植物病原菌有一定的抑制作用，对温度变化较为敏感，这与海水小球藻抗菌蛋白对热较为稳定不同［１３］。
　　目前，对植物病虫害的防治，主要采用化学合成的杀菌剂，但由于化学合成的农药毒性大，在自然界难以降解，致使生态环境受到严重的破坏。利用生物产生的天然活性物质直接作为杀菌剂或以其新颖的化学结构作先导化合物进行结构优化开发合成的类似物，已日益受到重视［１４］。本试验中所获得的抗菌蛋白具有广谱抗动植物病原菌的活性，因此，有必要深入探讨其抑菌作用的内在分子机制，为抗菌蛋白的研究建立基础［５］。
　　自２０世纪６０年代以来，国内外许多学者围绕紫球藻的分类、生态营养、培养及应用等方面进行了研究，取得了良好进展，但对其蛋白质生物活性的研究较少。因此，本研究可为今后进一步开发利用紫球藻提供有用的参考资料。
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