[新型酶固定化技术研究进展] 关于酶的最新研究进展

DOI:10.13746/j.njkj.2010.06.001

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酿酒科技·2010年第6期（总第192期）LIQUOR －MAKING SCIENCE ＆TECHNOLOGY 2010No ．6(Tol ．192)

新型酶固定化技术研究进展

张

萍，侯红萍

太谷

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西

030801）

摘要：酶的固定化技术是酶工程的核心技术之一，它的出现降低了酶制剂的成本，促进了酶的工业化应用。对新型的酶固定化技术进行了综述，包括共价固定法、氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素-亲和素亲和法、酶与金属离子的连接和疏水定向固定法及其他技术处理方法，并对固定化技术的应用前景进行了展望。关键词：酶；固定化技术；定向固定中图分类号：Q55；Q814

文献标识码：A

文章编号：1001－9286（2010）06－0082－04

Research Progress in Newly-developed Enzyme Immobilization Techniques

ZHANG Ping and HOU Hong-ping

(Collegeof Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

Abstract :Enzyme immobilization technology is one of the core technology of enzyme engineering. Such technology could reduce the production cost of zymin and advance industrial application of enzyme. In this paper, the newly-developed enzyme immobilization techniques were intro-duced including covalent immobilization, amino acid replacement method, antibody coupling method, biotin-avidin system method, connection of enzyme metal ions, hydrophobic oriented immobilization method etc. Besides, the application prospects of immobilization techniques were de-scribed.

Key words :enzyme; immobilization techniques; oriented immobilization

固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术，是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一、温和及酶的活性可调节控制等酶催化反应特性以外，还有分离回收容易、可重复多次使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点[1]。但传统的酶固定化方法有许多不足之处，为了实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失，有关专家进行了大量研究，或研发新型固定方法，或改进影响固定化的因素（例如载体），都取得了不错的效果。

[2]

素-亲和素亲和法；酶与金属离子连接和疏水定向固定法[3-6]。

图1A 酶的随意固定B 酶的定向固定

1.1共价固定法

酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性

1定向固定

定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热

地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团（如巯基）进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。（如图2B ）共价固定需要蛋白质分子表面有特异的基团可供反应，该基团必须远离活性中心。然而特异基团由低频氨基酸提供，在多数蛋白质分子表面难以寻觅，即使有，位置也不一定合适。

点，它解决了传统酶固定化方法中酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，酶活力低等问题。酶的定向固定（如图1B ）就是将酶蛋白能够以有序的方向和载体在特定的位点连接起来，有利于底物和活性中心反应，提高酶的固定化量。目前，定向固定的方法有以下几种：共价固定法；氨基酸置换法；抗体耦联法；生物

基金项目：山西省科技攻关项目(041030)。收稿日期：2010－03－29

张萍（1984-），女，山西大同人，在读硕士研究生，研究方向:食品微生物与发酵技术。作者简介：

侯红萍，教授，email:sphhpping@126.com。通讯作者：

张萍，侯红萍·新型酶固定化技术研究进展83

段保持了很好的催化活性(Kcat=20.0；KM(μm)=520)。抗体分子Fc 区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。孟艳丽[11]等研究了在硅片表面上通过A 蛋白定向固定抗体分子用于椭偏光学生物传感器免疫检测的可能性。结果表明，通过A 蛋白定向固定的抗体的抗原结合位点趋向一致，显著提高了抗体与抗原结合的能力。

1.4

图2酶标法中标记酶分子的随机固定(A)和定向固定(B)

生物素-亲和素亲和法

生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(＜

A ：异质性共价交联导致活性中心被屏蔽、同源自交

联、蛋白质构象改变等, 因而标记率低；

B ：通过分子操纵，控制酶蛋白固定方向，实现酶标

记的高剩余活力和均质性。

0.0001%)的中性小分子辅酶。亲和素是一个含有4个相

同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点（解离常数10-5mol/L ）。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。

Collioud [7]等化学合成一个异双功能试剂(N-[m-[3-(trifluoromethyl)diazirin-3-ly]phenyl]-4-maleimidobutyr amide) ，利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成

肽和抗体Fab" 片段的定向固定。Stein [8]等通过衍生全氟叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得了一致的空间取向。固定后的蛋白质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非离子去污剂清除。抗体结合显示该固定保持了蛋白质分子的天然构象。

Min [12]等将生物素羧化载体蛋白(BCCP)片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N 末端，然后将这两个融

合蛋白（BCCP -荧光素酶、BCCP-氧化还原酶）定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。Vishwanathl [13]等将携带一段生物素连接酶可识别肽链碱基序列的β-半乳糖酶基因融合到大肠杆菌细胞质DNA 中。经转录翻译后，表达出来的β-半乳糖酶特定位置N 端携带了可识别肽链。在生物素连接酶作用下，可识别端连接β-分子生物素。最后将修饰后的β-半乳糖酶与已连接有链霉

1.2氨基酸置换法

利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置

置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。半胱氨酸为低频氨基酸，在蛋白质分子中的出现频率约为2%，其巯基可以与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应。半胱氨酸还能与金属表面牢固结合，在二氢叶酸还原酶C 末端引入后，在金属表面固定的酶量比野生型酶高出4倍[6]。

-亲和素的聚醚砜膜作用，实现β-半乳糖酶的定点固定

化。研究发现，定点生物素化酶的活力是全生物素化酶的

Huang [9]等通过定点突变在枯草蛋白酶分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空

间折叠后暴露出Cys ，然后利用Cys 残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果。固定效率和固定后催化活性均有很大提高。

2倍，该法制备的生物催化膜的酶活是随机固定化法的近20倍。

1.5酶与金属离子连接

金属螯合载体可以和蛋白质表面供电子的氨基酸，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯醇基以配位作用紧密结合。

刘婷[14]等人采用反向悬浮包埋法制备了磁性琼脂糖微球，将其IDA 化后，加入一定量的CuC1溶液中，得到琼脂糖-IDA -Cu 螯合载体，利用金属螯合配体(IDA-

1.3抗体耦联法

大多数抗体具有足够的稳定性，承受各种活化与偶

联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团。可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。抗体的二硫键还原后形成的半分子亦可以提供远离抗原结合位点的巯基作为偶联位点。

Cu 2+) 与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理，定向

固定了木瓜蛋白酶。结果表明，固定化酶活力回收率为

68.4%，有较好的热稳定性，载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次的79.71%。Schmid 等将螯合剂次氮基三

醋酸共价结合在亲水性石英上，然后再连上二价金属离子(Ni2+) ，螯和剂-金属离子复合物上的自由协调位点可以和供电子基团如组氨酸连接。这样就可以通过金属离

Spitznagel [10]等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定

抗体酶(abzyme)48G7-4A 1的Fab ′片段，抗体酶Fab ′片

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子镍将蛋白质和载体连接在一起。次后，其剩余酶活仍能保持在72%。

1.6疏水定向固定法

细胞粘着分子(CAMs)是介导细胞-细胞、细胞-底

2.4超声波处理

在适当的超声场条件下，由于超声波的空穴和高频

物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分子和其他细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点A 糖蛋白可通过神经酰胺疏水固定在细胞表面。疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、生理活性及天然构象。这种通过疏水作用的固定，固定的效率高，固定为非共价，而且固定过程可逆，用去污剂可终止或消除固定反应。

振荡作用，反应液中的底物和产物分子在超声波的驱使下，以较高的频率振动，固定化酶与底物和反应物的接触次数大大增加，促使底物和产物分子迅速进入和排出载体，从而使固定化酶的反应速度增加，活力增大。

陈小丽、黄卓烈[19]等为了探索不同参数超声波对淀粉酶活性的影响效果，将水稻淀粉酶经分级盐析初步纯化后，用DEAE -纤维素进行柱层析。层析结果分离出2个蛋白峰，第1个蛋白峰无酶活力；第2个蛋白峰有很高的酶活力，且酶活力峰与蛋白峰吻合。将此峰中蛋白成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果显示的蛋白带比粗酶的蛋白带明显减少，经柱层析后淀粉酶被纯化13.726倍，将部分纯化的淀粉酶用适宜参数的超声波处理可以使酶活力提高9.09%～33.09%。

Stein [8]等用庚基胺修饰羧甲基葡聚糖载体表面的羧

基来疏水固定接触位点A 糖蛋白分子，成功地控制了固

定位点的空间取向。

22.1

其他技术处理

辐射处理

γ-射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性

醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。梁足培、桑明心、李建等将Co 60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性，在微波辐射下以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基，然后将交联的壳聚糖球浸泡在脲酶溶液中24h ，制备了壳聚糖球固定化脲酶，其酶比活为10183U/g载体。

[16]

2.5磁处理

磁性体Fe 3O 4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一

起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物），而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。

王艳、聂志勇[20]等建立了以纳米级磁性壳聚糖微球为载体固定化酵母醇脱氢酶的方法，优化了YADH 的固定化条件，考察了固定化酶的性质。结果表明，纳米级磁性壳聚糖微球呈规则的圆球形，粒径在30nm 左右，具有较好的磁响应性。相对于游离的酵母醇脱氢酶，固定化酶的最适温度略有升高，可明显改善其热稳定性、酸碱稳定性、操作稳定性和贮存稳定性。

2.2等离子体处理

等离子体用于固定化酶具有操作简单、条件温和、单

位面积固定的酶数量多、酶结合牢固等优点。刘小冲，孙巨峰、金文等利用Ar 等离子体引发PTFE 膜接枝丙烯

[17]

酸(AcrylicAcid) ，然后进行固定化脲酶，最终得到PTFE -

g -pAAc --i Urease 膜。结果表明，在PTFE 表面固定上了

脲酶，固定化脲酶保持了与溶液脲酶相当的活性，与溶液酶相比固定化脲酶的环境稳定性有较大的提高。

3展望

目前，酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工

2.3纳米技术处理

将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于

业、医药，特别是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。随着人类对环保的日益关注，酶的应用会更受关注，如何充分利用新载体、新方法来进一步提高固定化酶的活力、回收率、延长半衰期、降低成本必定会成为固定化酶研究领域的热点。同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点和方向，而固定化酶在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的发展。

纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。

薛正莲，汤斌[18]等分别以醋酸纤维素TiO 2膜(AC.

TiO 2膜) 、羧甲基纤维TiO 2膜(CMC.TiO2膜) 和聚丙烯TiO 2膜(PP.TiO2膜) 为载体吸附固定糖化酶，并与醋酸纤

维素、羧甲基纤维素和聚丙烯固定糖化酶的性能进行了比较，得出以AC.TiO 2膜和PP.TiO 2膜对糖化酶的吸附性能及稳定性能均较好，PP.TiO 2膜固定的糖化酶使用8

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