[根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究] 根癌农杆菌介导法
摘要介绍了农杆菌介导的植物原位转基因方法发展状况、技术环节以及在转化机制上的研究结果,并对存在的问题以及应用前景进行了讨论。 关键词根癌农杆菌;植物;遗传转化
中图分类号 Q943.2 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0143-01
1根癌农杆菌介导的基因转化原理
野生型根癌农杆菌是一种土壤病原细菌,它通过根部伤口侵入植物体,刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤,引发根癌病。该病在世界范围内普遍发生,患病植株株体衰弱,严重时整株死亡,在生产上危害极大。冠瘿瘤的形成是根癌农杆菌染色体外的遗传物质Ti质粒上的一段DNA(T-D NA)转移到植物细胞,整合到染色体组并进行表达的结果。这种具有天然转基因功能的质粒,改造后,在基因工程中可以用作基因转移的载体。根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称Ti质粒。野生型根癌农杆菌的Ti质粒含有2个与致瘤有关的区域:一个是T-DNA区,含有致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割、转移、整合过程起作用,用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒中致瘤基因删除,并在T-DNA区域插入适当的选择标记和多克隆位点。
2根癌农杆菌介导的基因转化的特点
2.1导入基因拷贝数低,表达效果好
农杆菌介导的转化向植物细胞导入的外源基因拷贝数大多只有1~3个,而其他方法往往会有几十个,大量拷贝会导致转基因的沉默。
2.2转化频率高
T-DNA链在转移过程中受到蛋白质的保护及定向作用,可免受核酸酶的降解,从而完整、准确地进入细胞核,转化效率较高。
2.3导入植物细胞的片段确切,且能导入大片段的DNA
Ti质粒上位于2个边界序列之间的外源基因片段均会转移到植物细胞,可避免其他理化方法将非目的基因片段导入植物细胞而造成潜在遗传物质扩散的危险。
3影响农杆菌转化效率的因素
3.1受体的来源及发育状态
应该选择活跃分裂的功能细胞,如愈伤组织胚性细胞、幼胚等,这些细胞处于良好的脱分化状态,DNA合成能力强,有利于T-DNA的整合。
3.2农杆菌菌株的选择与质粒的构建
超毒力的农杆菌菌株和超毒双元载体,能够增强农杆菌的侵染能力和T-DNA的整合能力,较好地克服农杆菌对单子叶植物敏感性差的问题。
3.3 vir基因活化物的使用
单子叶植物特别是禾本科植物受伤后分泌的诱导物质不足以形成有效的的信号,诱导农杆菌vir基因的表达。在共培养的培养基中,添加一定量的酚类化合物,能够取得良好的效果。
4根癌农杆菌转化应用范围与方法的拓展
4.1单子叶植物的转化
最早成功的转化是Bytebier等人用含有nos-nptI基因的重组Ti质粒感染石刁柏愈伤组织,并且获得抗卡那霉素的再生植株。
4.2真菌的转化
Bundock等人成功转化了酵母、木霉、曲霉、镰孢霉、刺盘孢霉、脉孢霉以及伞菌等多种丝状亚菌。真菌的成功转化寻找到一种新的真菌基因工程改造方法,可作为研究宿主与T-DNA转化互作关系的较好的分子体系。
4.3 裸子植物的转化
由于受到外植体培养、转化和选择频率等影响,Ti质粒转化裸子植物一直受到限制。1999年Wenck等人使用含有附加拷贝virG和(virD+virB)基因的Ti质粒转化挪威云杉,获得100多个Gus表达株系,从而建立了裸子植物的转化体系。
5根癌农杆菌转化应用中存在的问题
5.1转化机理方面
在转化过程中,农杆菌本身的分子调控研究比较深入,但是有关植物因子的了解尚处于初级阶段。此外,农杆菌介导的转化过程T-DNA往往是单或者低拷贝整合的原因尚不清楚。
5.2转化策略方面
向植物体内导入大片段DNA的工作有待深入,尤其是有重要经济价值的禾谷类和豆科植物大片段DNA转入的研究还未见报道。
5.3转化方法方面
现今农杆菌介导的单子叶和谷类植物的转化基本以幼胚为起始材料,取材受到生长周期限制。因此,实践上迫切需要发展一些容易并且能够经常大量获得的外植体的农杆菌转化体系,不需要组培而直接获得转基因植株的方法将十分有意义。
6参考文献
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