盐溶性蛋白 利用盐溶蛋白UTLIEF技术快速鉴定玉米种子纯度
摘要：利用盐溶蛋白超薄等电聚焦电泳技术对６个同父异母、５个同母异父共１１个玉米杂交品种种子进行纯度鉴定。结果显示，盐溶蛋白超薄等电聚焦电泳图谱带型稳定，多态性丰富，分辨率高，可将供试的血缘关系较近的玉米杂交品种区分开，而且该技术操作简便，可用于玉米种子纯度的快速鉴定。
关键词：玉米；盐溶蛋白；超薄等电聚焦电泳；纯度鉴定
中图分类号：Ｓ５１３文献标识码：Ｂ文章编号：0439－８114（２０11）13－2613-02
The Application of Salt-soluble Proteins UTLIEF in Maize Purity Identification
ＺＨＥＮ Ｇｕａｎｇ－ｔｉａｎ
（Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＴＬＩＥＦ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １１ ｍａｉｚｅ ｈｙｂｒｉｄｓ（５ ｏｆ ｔｈｅｍ shared a ｓａｍｅ ｆａｔｈｅｒ ａｎｄ ６ ｏｆ ｔｈｅｍ shared a ｓａｍｅ ｍｏｔｈｅｒ） ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＴＬＩＥＦ ｃｏｕｌｄ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ １１ ｍａｉｚｅ ｈｙｂｒｉｄｓ as ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｈａｄ ｓｔａｂｌｅ ｓｔｒｉｐ， ｇｏｏｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ was ｅａｓｙ ａｎｄ ｃould ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）； ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＵＴＬＩＥＦ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
近年来，由于玉米骨干自交系的使用日益集中，导致我国玉米种质遗传基础日趋狭窄，利用传统的形态鉴定方法难以鉴定血缘关系较近的玉米杂交种，利用分辨率高的ＤＮＡ分子标记鉴定方法不但投资昂贵，而且费时费力，并非一般单位所能承受得起［1］。种子盐溶蛋白超薄等电聚焦电泳
（ＵＴＬＩＥＦ）技术被认为是一种简便、快速、可靠且成本较低的鉴定方法，已被写入国际种子测试协会（ＩＳＴＡ）的种子检验规程［2］。本研究以辽宁地区种植的６个同父异母和５个同母异父共１１个玉米杂交品种为试验材料，研究利用种子盐溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ技术鉴定玉米种子纯度的可行性。
１材料与方法
１．１试验材料
供试的１１个玉米杂交品种及其亲本（表１）均为沈阳市农业科学院近年来育成。
１．２蛋白质提取
每个品种设３次重复，每次重复随机取５０粒种子。将单粒种子用电动种子粉碎机（北京市六一仪器厂）粉碎，装入１．５ ｍＬ离心管中，加入蛋白质提取液静置提取１．０～１．５ ｈ，用涡旋振荡器振荡混匀处理１ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液备用。
１．３超薄层聚丙烯酰胺凝胶制备
将１片Ｇｅｌ－Ｆｉｘ聚酯胶片（２６７ ｍｍ×１９３ ｍｍ，购自ＧＥ公司）放在玻璃板上，将５ ｍＬ凝胶液（内含凝胶贮存液５ ｍＬ、牛磺酸０．１６ ｇ、尿素０．８ ｇ、ｐＨ值５～９的Ｓｉｎｕｌｙｔ ２２０ μＬ、０．２ ｇ／ｍＬ的ＡＰＳ ３０ μＬ、ＴＥＭＥＤ ６ μＬ）倒在聚酯胶片上，盖上涂有疏水硅烷的玻璃板，静置４５ ｍｉｎ以上，待凝胶完全聚合后打开模具，取出凝胶。因上面玻璃板两条长边均贴有厚度为０．１２ ｍｍ的电工胶布作为上下两板间隔，所以制出的聚丙烯酰胺凝胶厚度即为０．１２ ｍｍ。
１．４超薄层等电聚焦电泳
将带有凝胶的聚酯胶片放置在水平平板电泳槽的冷却板上。把经正、负电极缓冲液充分湿润的电极纸条分别放于凝胶两端。在离正极电极条１．５ ｃｍ处放置点样带（５２孔），向点样孔中加入２０ μＬ蛋白质提取液。聚焦温度设定为４ ℃，电泳８０ ｍｉｎ聚焦完成（首先将电泳电压设定为６００ Ｖ电泳３０ ｍｉｎ，然后再将电压升至１ ０００ Ｖ电泳５０ ｍｉｎ）。将聚焦后的胶片在０．１２ ｇ／ｍＬ的三氯乙酸中固定２０ ｍｉｎ，经考马斯亮蓝染色液染色５０ ｍｉｎ，然后脱色２０ ｍｉｎ，于室温下晾干，过夜。凝胶晾干后经扫描仪（上海中晶科技有限公司）扫描，得到ＵＴＬＩＥＦ图谱。
１．５结果统计与分析
通过分析ＵＴＬＩＥＦ图谱，统计异常带型的样本数量，按下列公式计算品种纯度：
品种纯度＝（供试种子数－异粒数）／供试种子数×１００％
２结果与分析
通过对１１个玉米杂交品种单粒种子盐溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ图谱的分析，发现其盐溶蛋白超薄等电聚焦电泳图谱带型稳定，多态性丰富，分辨率高，可将供试的血缘关系较近的玉米杂交品种区分开，而且该技术操作简便，可用于玉米种子纯度的快速鉴定。以沈单１６号和沈玉２３号为例，单粒种子盐溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ的电泳图谱如图１和图２。沈单１６号（图１）与沈玉２３号（图２）的带型明显不同，而且在图１中，９号样本的带型与其他种子明显不同，因此认为９号样本为混入的其他品种的种子。图２中１０号样本的带型与其他种子明显不同，可确定为母本自花授粉子粒或混入的其他品种的种子。通过统计异常带型的样本数量，依据上述公式，计算各供试品种的纯度，鉴定结果如表２。
３讨论
玉米种子贮藏蛋白质具有遗传差异表达稳定、多态性丰富和提取容易等特点，因而作为鉴别品种间遗传差异的重要生化标记，在品种纯度检验上有着非常重要的意义［3，4］。通过改进的ＵＴＬＩＥＦ，本研究分离到的玉米种子盐溶蛋白质谱带有十几条到几十条不等，足够通过分析多态性鉴定其纯度。研究结果显示，单粒种子盐溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ图谱提供了亲缘关系较近的品种在蛋白质水平上的较大变异，依据这些变异，可有效地鉴定品种纯度。该试验提供的鉴定技术采用的电泳设备和两性电解质试剂均实现了国产化，大大节约了成本，但在技术的标准化、结果分析及标准品种电泳图谱的建立等方面还需要做进一步研究。
参考文献：
［１］ 张余良．农业种子真伪鉴别与防伪的进展［Ｊ］．天津农业科学，１９９８，４（１）：５３－５６．
［2］ ＧＢ／Ｔ３５４３－１９９５，农作物种子检验规程［Ｓ］．
［3］ 严敏，赵延明，赵婷，等，基于超薄等电聚焦电泳技术的杂交水稻种子纯度鉴定［Ｊ］．中国农学通报，２００７（１２）：２１－２５．
［4］ 王晓峰，赵婷．超薄等电聚焦电泳技术及其在种子纯度鉴定中的运用［Ｊ］．种子，２０００（６）：５５－５７．
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