[细胞毒性实验] 细胞毒性实验原理
下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5
个,否则难以反应真实情况
3.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5.终止培养,小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
悬浮细胞:
1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 l?g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对
照(加100?(储存液100 1640)。
2)置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm
(630nm校准)测量各孔的吸光值)
4)离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm
校准)测量各孔的吸光值。
5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的
药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
(三)MTT的配制
MTT一般最好现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
液器比移液管精确得多,但是如果操作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。
首先说说我的一点经验:
1.吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3到4倍,可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。
2.吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管,总液量在5ml左右为益
3.吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。
(五)加入MTT
个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例,具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定,我认为MTT多加一些比少加好一些
MTT的量各家报道不同,一般是过量的,所以10ul即够了。如果不使用96孔板,培养基超过100ul,MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀,不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应,所以可以单独将药物和MTT加在一起,看会不会起反应。如果不起反应,就不用去除含药物的培液,直接加MTT即可。