优化生态安全什么体系【均匀设计优化建兰ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系】

　　摘 要：采用均匀设计，对影响建兰ISSR―PCR体系的引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化，建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中，含引物0.25tLmol/L、Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA 40ng.在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度，以及ISSR引物进行筛选，筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min；接着进行32个循环：94℃变性35s，52－56℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束后，72℃延伸10min.同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。
　　关键词：建兰；ISSR―PCR；均匀设计
　　中图分类号：Q949.662
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01-0058-06
　　
　　建兰(Cymbidium ensifolium(Linn.)Sw.)为兰科(Drchidaceae)兰属(Cymbidium)植物，极具观赏和经济价值，兰科植物广泛分布于各种生态环境，表现有高度特异的形态、结构和生理特性，建兰也不例外，长期的自然杂交以及人工选育，品种间存在很高的遗传分化和种间类型，这为杂交育种选配亲本提供了丰富的种质资源；但同时，仅凭花色、花型、叶色、叶型、花梗等传统的形态指标来辩识品种，则存在很大难度，这不仅给品种的整理和研究带来困难，同时也影响新品种的注册登录和产权保护。
　　以DNA指纹图谱为指标的分子标记技术，标记的位点数远大于形态标记和生化标记，且不易受环境因素的影响，可弥补或解决形态标记和生化标记中的缺陷或难题，因此，被广泛用于植物品种的鉴定，ISSR(inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间)是Zietkiewicz等在SSR(simplesequence repeat，简单序列重复)基础上创建的，基于PCR技术的一种新型分子标记，其基本原理是利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，而无需预先克隆和测序，用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16－18个碱基序列，其主体是2－4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5′端或3’端加上1－4个锚定碱基，引起特定位点退火，使引物与相匹配的SSR的一端结合，从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，ISSR分子标记操作简单，可揭示的多态性较RAPD和RFLP、SSR高，重复性较RAPD好。成本较AFLP低，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、生物进化及分子生态学研究等，显示出了广阔的应用前景。
　　然而，ISSR分子标记是基于PCR技术的，其反应结果同样受诸多因素的影响，因此在应用IS-SR标记技术时，需针对研究的物种，对ISSR-PCR体系和扩增程序进行优化，以期获得多态性高、稳定性好的扩增结果，确保标记的可靠性，优化IS-SR-PCR体系和扩增程序，目前大多采用单因子试验法，即依经验确定一个起始条件，然后依次调整某个因素，使实验结果接近最佳，单因素试验忽略了因素间的综合效应，结果很难达到预期的最优化，均匀设计是在正交设计的基础上发展起来的一种适用于多因素多水平的试验设计方法，与正交设计对比，均匀设计只考虑试验点在试验范围内的均匀分散，而忽略了整齐对比，其特点是任何一个因素的诸个水平作相同数目的试验，因此，试验次数大大减少，本研究采用均匀设计，对影响ISSR-PCR的主要因素Mg2+、dNTP、引物以及Taq DNA聚合酶浓度等分别进行5水平和3水平两轮优化实验，获得建兰ISSR-PCR体系的优化组合，并在此基础上对ISSR-PCR扩增程序中的退火温度和反应循环次数进行比较筛选，旨在建立适合于建兰的ISSR-PCR条件，进一步为建兰的品种鉴定、种质资源保护和分子辅助育种等的研究奠定基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　实验所用建兰样本取自福建省龙岩市连城县朋口镇福建兰花基地，用手术剪剪取建兰嫩叶，蒸馏水冲洗干净，凉干水分，称0.2g于已灭菌的研钵中，加2mL SDS高盐提取介质和少量石英砂，迅速研磨，匀浆移至离心管，置冰盒中带回实验室，-18℃冰箱保存。
　　
　　1.2 DNA提取和质量检测
　　建兰DNA提取和质量检测按文献[11]进行，
　　
　　1.3 ISSR-PCR体系优化
　　参考有关DNA模板浓度对ISSR-PCR体系的影响，发现ISSR-PCR对DNA模板浓度不甚敏感，在20μL反应体系中20－60ng的模板均能有稳定而清晰的扩增，为此，本实验在20μL反应体系中，将模板DNA设为定值40ng。
　　针对4个影响因子：MgM2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度，采用两轮均匀设计对建兰ISSR-PCR体系进行优化。
　　
　　首先，对4个影响因子，各设置5水平进行考察(表1)，根据均匀设计表U20(54)安排第1轮实验(表2)。
　　对第1轮实验结果进行分析，初步筛选出优化组合，并以此作为第2轮均匀设计的依据，第2轮均匀设计的因素和水平见表3，选择均匀设计表U12(3sup>3)安排实验(表4)。
　　以提取的建兰DNA为模板，UBC836为引物，根据表2和表4分步制备总体积为20μL，内含40ng模板DNA的ISSR-PCR体系，在Biometra T型Thermoeycler仪上进行扩增，扩增程序为：94℃预变性5min；接着进行32个循环：94℃变性35s，56℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束后，在72℃延伸10min，于4℃=保存，扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，溴乙锭染色后，于凝胶成像仪上观察并照相记录，实验设置一个空白对照。
　　1.4 ISSR-PCR扩增程序优化
　　以第2轮均匀设计优化的反应体系为基础，对建兰ISSR-PCR扩增程序中的循环次数和退火温度进行筛选优化，循环次数设3个梯度：30、32和35次；退火温度范围为50－56℃，变化梯度为1℃。
　　
　　1.5 优化的反应体系和扩增程序的验证
　　通过增加模板数量、更换引物以及重复实验对优化的反应体系和扩增程序进行验证。
　　实验所用引物，参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列。由上海生工生物工程有限公司合成，Mg2+，dNTP和TaqDNA 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 聚合酶购自TaKaRa公司。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2.1 ISSR-PCR体系的均匀优化
　　第1轮4因素5水平均匀设计共20个处理组合的ISSR-PCR体系的扩增结果见图1.从图1可以看出，不同因素水平组合的ISSR-PCR体系的扩增结果差异显著：组合1和9没有扩增，组合4和18有少量扩增产物，但无法辨识；组合2和15扩增带谱弥散，难以区分；组合7、8和19扩增带谱强，但有拖带现象，辨识困难；组合5、6、13、14、16、17和20扩增带谱少，其中组合5和6带谱也很弱；综合扩增带谱的数目、强弱、清晰度和可分辨率等指标，组合11是比较理想的模式，因此，初选组合11(20μL反应体系中，含Mg2+1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶lU，模板DNA 40ng)作为第1轮均匀设计优化的结果。
　　
　　为获得理想的ISSR-PCR体系，在组合11对应的因素水平基础上，进行第2轮均匀设计筛选，图2为第2轮4因素3水平均匀设计共12个处理组合的ISSR-PCR体系的扩增结果，由图2知，12个组合中，组合3、4、8和12扩增带谱少且弱，效果差；组合1和2扩增带谱数较多，强弱较均匀且清晰可辨，是比较理想的扩增模式，相比而言，组合2较组合1，带谱强弱差异更小、明晰可辩，故确定组合2(20μL反应体系中，含Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.25μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，模板DNA 40ng)为建兰ISSR-PCR体系的第2轮均匀设计筛选结果。
　　
　　2.2 循环次数和退火温度对ISSR-PCR的影响
　　PCR循环次数的多寡，对扩增结果的影响十分显著，理论上，循环次数越多，扩增产物产率越高，但实际上，扩增产率会受反应体系中各反应组分用量的限制，如循环次数超过40，则酶的消耗达到一个平台，产率很难再提高，为获得理想的扩增效果，以第2轮均匀设计优化的反应体系，在原扩增程序的基础上，分别测试了30、32和35个循环(其它条件不变)对建兰ISSR-PCR扩增结果的影响，图3 A、B和C分别为30、32和35次循环的ISSR-PCR扩增结果，不难看出，随着循环次数的递增，扩增带谱由弱变强，表明随着循环次数的增加扩增产率呈较明显的递增趋势，比较而言，32次循环对建兰ISSR-PCR的扩增是适宜的。
　　ISSR引物对PCR退火温度极为敏感，同一引物，对不同的物种其退火温度不尽相同；同样，对同一物种，不同的引物其退火温度亦不尽相同，因此，不同引物退火温度的筛选需反复调试，本实验从100个ISSR引物(UBC公布的第9套引物)中筛选出扩增条带清晰、重复性较好的14个引物用于PCR扩增，14个ISSR引物的退火温度在52－56℃之间，其中，引物UBC807、UBC836、UBC857的退火温度为56℃；引物UBC828、UBC835、UBC841、UBC845、UBC852、UBC853的退火温度为54℃；引物UBC814、UBC815的退火温度为53℃；引物UBC808、UBC825、UBC827的退火温度为52℃，
　　
　　2.3 优化的反应体系和扩增程序的验证
　　应用上述优化的ISSR-PCR体系和扩增程序，用筛选的14个引物，对36个建兰品种的DNA进行PCR扩增，均能获得丰富、清晰可辨的DNA带谱，图4是引物UBC828对36个建兰品种DNA的扩增结果。
　　
　　
　　
　　3 讨论
　　
　　均匀和正交设计可以解决多因素、多水平试验中，各因素、水平间的交互效应，与正交设计对比，均匀设计的最大优点是试验次数大大减少，如本研究的第1轮实验，若运用正交设计，实验处理组合数为100，是均匀设计处理组合数20的水平数(5)倍，对于水平数高的多因素试验，运用均匀设计显然可以事倍功半。
　　本研究应用均匀设计，只经两轮实验，就获得了建兰ISSR-PCR体系的优化组合，但由于实验结果的评判指标是定性的，无法用数学方法进行定量分析，因此实验结果未必是最佳，进一步的改进，可以从以下几方面着手：1)将扩增产物量化，量化后可用线性回归等数学方法对结果进行计算分析，从中求得最佳；2)增加试验重复次数，重复次数增大，可供选优的几率增加，但工作量也将成倍增加；3)缩小各因素水平问的差值，水平间的差值减小，结果的评判指标差异缩小，对优选有益，但上作量随之增加，结果评判的人为影响亦增大。
　　由于ISSR引物较长(16－18个碱基序列)，以及5′端或3′端1－4个锚定碱基与互补的SSR序列的耙定作用，要求退火温度较RAPD高，另外，不同ISSR引物对退火温度的要求不一，因此，对IS－SR-PCR扩增程序中的退火温度，应针对不同引物进行筛选，以期获得稳定、可靠的标记结果。
　　
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