[三裂叶野葛毛状根的生长及其培养基营养物质的消耗变化]培养基营养物质

　　摘 要：研究了发根农杆菌(Agrobacterterium rhizogenes)ATCC15834遗传转化产生的三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)毛状根在液体培养过程中生长及其部分营养物质消耗的关系，结果表明：三裂叶野葛毛状根液体培养0－4d内处于生长迟滞期、8－16d为快速生长期、16d后进入生长平台期，培养基的PO4、硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗，培养16d时培养基中的PO4被消耗殆尽，其浓度仅为培养基起始PO4浓度的0.26％；培养基的铵态氮和硝态氮则在培养20d时才消耗殆尽；而培养基中的ca2+浓度在培养过程中逐渐降低，但在培养20d时仍未被完全消耗，其浓度约为起始浓度的30.5％，培养基的pH值随培养时间的延长而不断降低，培养20d后pH值由5.62降低到4.09；而毛状根的颜色也随培养基pH值的降低和培养时间的延长逐渐由白色变成浅黄色和浅褐色，该结果为今后设计合适的培养基以开展野葛毛状根的大规模液体培养来生产葛根素提供了可能性。
　　关键词：三裂叶野葛；毛状根；ca2+；氮源；磷酸盐
　　中图分类号：Q945
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01-0052-06
　　利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri (root inducing)质粒遗传转化产生的可自主生长 的毛状根培养物来生产药用植物的次生物质，已 在人参(Panax ginseng)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和青蒿(Artemisia annua)等多种药用植物中获得成功，三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)是豆科葛属的药用植物之一，其根部所含的葛根素、大豆甙等异黄酮类化合物，具有解毒退热、抗心律失常及改善心脏的血液循环等功效以及具有类似雌性激素的作用，我们曾利用发根农杆菌ATCC15834对三裂叶野葛的遗传转化，获得了能在无激素的培养基上自主生长，又能产生葛根素的毛状根，但如何建立该毛状根离体培养的最佳培养条件，就成为利用该毛状根批量培养或发酵培养来生产葛根素等药用次生物质的基础及前提条件。
　　植物毛状根培养所用的培养基一般由无机元素、有机附加物等组成，已往的研究表明，培养基的重要组成成分如无机营养元素等的变化能影响植物悬浮细胞培养物以及毛状根的生长及其次生代谢物的产生，但有关这些组分在培养基中的代谢变化及其与毛状根的生长、形态变化等方面的研究较少，本文通过对三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基无机元素N、Ca和P消耗的研究以及培养过程中培养基pH值变化的测定，来确定三裂叶野葛毛状根液体培养周期中氮源和无机元素的用量，为今后开展三裂叶野葛毛状根大规模培养中氮源和无机元素的及时补充和起始浓度的确定等提供参考。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 供试材料与培养基
　　以发根农杆菌(A.rhizogenes)ATCC15834诱导三裂叶野葛叶片外植体产生的、能在无外源激素培养基上自主生长又能产生葛根素的毛状根为培养材料，有关该毛状根的诱导方法见文献[6]，所用的培养基为MS液体培养基，其中蔗糖浓度为30g/L，灭菌前培养基的pH5.8，高压蒸汽灭菌后，其pH值为5.62，另外，采用在MS培养基中添加10mmol/L MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid](pH值稳定剂)来比较pH值的变化对三裂叶野葛毛状根液体培养的影响。
　　
　　1.2 毛状根液体培养及其生长的测定
　　将来自同一克隆系的生长旺盛的三裂叶野葛毛状根切成长4-5cm、具根尖的毛状根根段，接种至盛有50mL不加MES的MS液体培养基的250mL三角瓶中，毛状根起始接种量为0.2g鲜重／瓶，将培养瓶置于转速为110r/min旋转式摇床中，于黑暗、(25±2)℃下振荡培养，在为期20d的培养过程中，每隔4d随机抽取毛状根培养物各4瓶，用无菌水冲洗2次后、用滤纸吸干毛状根培养物表面的水分后，进行毛状根生长量(干重)测量；同时，取出毛状根培养物后的培养基经滤膜过滤后，滤液保留于超低温冰箱中，供培养基中N、P和Ca消耗量的测定及pH值变化的测定用。
　　
　　1．3 培养液中NO3、NH4和PO4含量的测定
　　当毛状根接种至液体培养基后，分别在培养后的4、8、12、16和20d取残余培养基过滤、去离子水定容后，测定其NO4、NH4、Ca2+和PO4含量的变化，其中，培养基中硝态氮和磷酸盐含量的测定按张志良等(2003)的方法；培养基中铵态氮的测定按照参考文献[13]的方法进行；而培养基中Ca2+浓度的EDTA络合滴定按照阮湘元等(1998)的方法。
　　
　　1．4 培养基pH值变化的测定
　　当毛状根接种至液体培养基后，分别在培养后的4、8、12、16、20d取培养基过滤后，分别用pH计直接测定毛状根培养基的pH值的变化，实验重复测定3次，取平均值。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2．1 三裂叶野葛毛状根的生长特性
　　三裂叶野葛毛状根接种至液体MS培养基中培养2-3d后，可观察到从毛状根根段开始产生出新的白色分枝根，而且随着培养时间的延长，从起始毛状根根段产生的分枝根越来越多，根段也不断伸长；同时发现，随着培养的进行，毛状根的颜色逐渐由白色变为浅黄色；培养12d后，还可观察到少部分毛状根开始出现局部轻微褐化，图1为三裂叶野葛毛状根在液体培养过程中的生长变化，从图1可见，三裂叶野葛毛状根在接种后1－4d处于生长停滞期；在培养4－8d内毛状根的生长比较缓慢，培养8－16d毛状根培养物进入快速生长期，表现在其生物量(干重)迅速增加，但培养16d后毛状根培养物的生长变缓，进入生长的平台期(图1)。
　　
　　
　　2．2 毛状根液体培养过程中培养基NO3-和NH4+的消耗变化
　　
　　图2为三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基中氮源的消耗变化，从图2可见，在三裂叶野葛毛状根液体培养过程中，培养基中的硝态氮和铵态氮均被逐渐消耗，并与毛状根的生长变化基本同步；在毛状根接种后0－4d的生长停滞期内，培养基中的氮源消耗很少，但当毛状根进入生长时期(即培养后4－16d之间)，培养基中的氮 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 源无论是硝态氮还是铵态氮均被不断消耗，尤其是在毛状根快速生长期(8－16d)，其硝态氮和铵态氮浓度都急剧下降；至培养20d时，培养基中的铵态氮和硝态氮均已消耗殆尽；此时毛状根的生长速率减慢，其颜色也逐渐由白色或浅黄色开始不同程度变褐，该结果表明，三裂叶野葛毛状根液体摇瓶培养时，其培养基中硝态氮和铵态氮的代谢周期约为20d。
　　
　　2．3 三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基中PO43-的消耗变化
　　PO43-作为参与植物细胞能量合成和代谢的重要元素，它的消耗变化可反映毛状根的生长和代谢状况，从图3可见，在三裂叶野葛毛状根接种后0－4d的生长停滞期内，毛状根的生长虽然极为缓慢，但其培养基中的PO43-含量则逐渐下降；而当毛状根逐渐进入快速生长期时(接种后4-16d)，培养基中的PO43-的浓度则急剧下降，表明培养基中的PO43-被迅速吸收和消耗；至培养16d时，培养基中的PO43-被消耗殆尽；通过测定发现，此时液体培养基中的磷酸根含量仅为0.31mg/L，仅为培养基起始PO43-浓度的0.26％，这表明在液体培养过程中三裂叶野葛毛状根对培养基中磷酸盐的吸收和利用较为完全，且比氮源快，因而，磷可能是影响毛状根生长的重要因素之一。
　　
　　
　　2．4 三裂叶野葛毛状根培养过程中培养基Ca2+的消耗变化
　　图4为三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基Ca2+的代谢变化，从图4可见，培养基中Ca2+浓度随着培养时间的延长逐渐降低，但与培养基中的PO43-、硝态氮和铵态氮的消耗变化相比，毛状根对Ca2+的吸收和利用速度相对较慢且不完全；当培养基中的PO43-、硝态氮和铵态氮在培养20d时分别被完全消耗或消耗殆尽后，此时培养基中仍残存有占起始浓度约30.5％的Ca2+，这表明，钙虽然是三裂叶野葛毛状根生长所必需的矿质元素，但毛状根对钙的吸收和利用要比N和P慢得多。
　　
　　
　　2．5三裂叶野葛毛状根培养过程中pH值的变化
　　
　　三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基pH值的变化趋势如图5所示，MS培养基的pH值为5.8，经高压灭菌后pH值为5.6，从图5可见，在毛状根培养过程中培养基的pH值逐渐下降；培养4d后，培养基的pH值下降至5.2；培养20d时pH值下降至4.09，与此同时，我们还发现，随着培养基中pH值的不断下降，毛状根的颜色也逐渐由白色变为浅黄色，并在培养12d时开始不同程度变为浅褐色，培养20d后大部分毛状根已变褐(图6，B)，而当我们采用含有添加10mmol/L MES(作为培养基pH值稳定剂)的MS液体培养基培养时，发现毛状根不仅生长旺盛，而且毛状根的褐化程度也有明显的改善，可观察到在培养16d后毛状根仍为白色，未见褐化产生(图6，A)；但培养至24d后，添加MES的液体培养基培养的毛状根的老根段(起始根段)也开始出现少量褐化。
　　
　　
　　3 讨论
　　
　　硝酸盐和铵盐是毛状根培养基中最重要的氮源，已有的一些研究大都集中在研究培养基中硝态氮和铵态氮的比率或改变二者间的浓度配比对毛状根生长及其次生代谢物积累的影响，如在青蒿毛状根培养时发现，培养基中硝态氮和铵态氮的比率为5:1，总氮量为20mmol/L时，最有利于毛状根中青蒿素的产生，而培养基的硝态氮和铵态氮比率还能明显影响Atropa belladonna毛状根的生长及其次生物质东莨菪碱(Scopolamine)／天仙子胺的比率；而且降低培养基中的硝态氮浓度还可促进毛状根中生物碱的产生，此外，在培养基中添加NO3-能使Daturacandida×D.aurea毛状根的生物量增加及显著提高天仙子胺生物碱的含量，但同时会使毛状根的东莨菪碱含量明显降低，相比之下，对毛状根培养过程中氮源本身的消耗速率与毛状根生长的关系研究较少，在培养栝楼(Trichosanthes kirilowii)毛状根时，培养基的铵态氮和硝态氮随着生长的进行而被逐渐消耗，在培养24d时铵态氮已被完全消耗，而此时硝态氮则仍有17％未被消耗和利用，而这也与我们的结果不完全一致，在我们的试验中，三裂叶野葛毛状根液体培养20d后，培养基中的硝态氮和铵态氮均被消耗殆尽，我们推测这种差异的产生可能与植物毛状根的类型有关。
　　磷(P)也是植物细胞或离体器官培养基中的大量元素，在培养长春花(Catharanthus roseus)毛状根时发现，培养基中的磷酸盐在培养8d后就被全部消耗完毕，You-Ichiroh等(1997)也发现。培养基中PO43-消耗最快，而总氮量消耗量次之，而在青蒿毛状根的液体培养过程中，培养液的铵态氮、硝态氮和磷酸盐的消耗变化都与毛状根的生长成正相关，其中尤以磷酸盐的消耗最快，约在接种后15d被完全吸收，这与我们的结果基本一致，在本实验中，培养基的硝态氮和铵态氮和磷酸盐在三裂叶野葛毛状根液体培养过程中均被迅速消耗，培养16d时，培养基中的磷酸盐被完全消耗，而铵态氮和硝态氮则仍有极少量残留，与P一样，钙也是植物细胞生长发育必需的矿质元素，有研究表明，培养基中的Ca2+浓度或Ca2+的拮抗剂等能提高Polygonum hy-dropiper悬浮细胞黄酮醇的产量或促进长春花毛状根中吲哚生物碱的产生和释放；而提高培养基的Ca2+浓度虽对天仙子(Hyoscyamus albus)毛状根的生长无明显影响，但却能明显提高毛状根中托品生物碱的产量；然而，至今为止有关毛状根培养过程中培养基中Ca2+浓度消耗变化的研究极少，我们的结果表明，在三裂叶野葛毛状根培养过程中，培养基的Ca2+可被毛状根逐渐吸收和利用，但与培养基的磷酸盐、铵态氮和硝态氮的消耗变化相比，毛状根对Ca2+的吸收速度慢且利用不完全。
　　有研究表明，培养基pH值的变化与毛状根的生长息息相关，如青蒿毛状根生长的最适pH值在5.5-6.5之间；而粟米草(Mollugo pentaphylla L.)毛状根生长的最适pH值为5.4-5.8，而在火焰菜(Beta vulgaris L.)毛状根液体培养过程中，培养液的pH值在培养初期由5.8迅速下降到4.6，而在随后的培养过程中，pH值始终在4.6左右，可见，不同植物毛状根培养时，其培养基pH值会发生变化，并且其生长的最适pH可随植物种类而异，此外，在我们的实验中发现，采用添加MES的液体MS培养基来培养三裂叶野葛毛状根，可推迟或明显减轻毛状根的褐化，并且发现在毛状根培养后期，添加MES的MS培养基也不会变成褐绿色，这可能表明，三裂叶野葛毛状根的培养可能需要一个较为稳定的pH值。
　　我们的结果表明，培养基的铵态氮、硝态氮、磷酸盐和Ca2+的消耗变化及其pH值的变化可困植物毛状根的种类和培养体系的不同而有所差别，而通过对培养基中氮源和磷酸盐等消耗变化的测定，将能为大规模培养毛状根时确定培养周期以及整个培养周期中氮源和磷酸盐等的供给量提供理论依据和技术参数；本实验的结果为今后开展三裂叶野葛毛状根的规模培养奠定了实验和技术基础。
　　
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