【十二份三系杂交稻亲本的指纹图谱构建与应用】指纹图谱

　　摘要：选取分布于水稻１２条染色体上的１１２对ＳＳＲ引物对１２份杂交稻亲本进行多态性分析，检测出３５对多态性引物。选取其中２５对多态性好的引物构建了１２份杂交稻亲本的指纹图谱。利用特异引物分别对万优２号和Ｋ优８８的杂交种进行纯度鉴定，结果表明，分子标记纯度鉴定与田间鉴定结果差异不明显。
　　关键词：杂交稻；指纹图谱；纯度鉴定
　　中图分类号：Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2122-03
　　
　　Construction and Application of Fingerprinting Map of 12 Ternary Hybrid Rice Parents based on SSR Marker
　　
　　ＨＵ Ｊｉｎｇ－ｔａｏ，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ－ｚｈａｎｇ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎ，ＨＵＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｉ，ＬＥＩ Ｓｈｕ－ｆａｎ，Ｌ?� Ｚｈｉ－ｗｅｎ
　　（Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１５５， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ １２ ｔｅｒｎａｒｙ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｂｙ ｃｈｏｏｓｉｎｇ １１２ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ １２ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ； and ３５ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ｌａｓｔ． ２５ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ １２ ｔｅｒｎａｒｙ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｗａｎｙｏｕ－２ ａｎｄ Ｋｙｏｕ－８８． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ result of ＳＳＲ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｍａｐ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　
　　ＤＮＡ指纹反映同种生物体中的个体差异，由于个体ＤＮＡ序列信息具有相对的稳定性，因此可结合现代分子生物学方法构建指纹图谱。在水稻研究中，指纹图谱可用于杂交稻种子的真伪及纯度鉴定，避免田间鉴定的繁琐工作，同时为品种或材料申请专利保护提供分子水平的依据。
　　ＳＳＲ作为基因组研究中的一种主要分子标记技术，在水稻中，已经广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定及遗传图谱构建等研究。李云海等［１］利用ＳＳＲ标记分析了生产上常用的杂交稻亲本，结果表明，生产中主要应用的水稻雄性不育系遗传背景较为单一。郭慧等［２］利用ＳＳＲ标记分析了２４份水稻雄性不育系的遗传多样性，结果表明，四川及其他省（区）使用的细胞质雄性不育系之间的遗传基础较窄。姜树坤等［３］利用ＳＳＲ标记对辽宁省大面积种植的１４个主栽品种进行了遗传多样性分析，结果表明，多数品种的亲缘关系较近，多样性不够丰富。李进波等［４］利用ＳＳＲ标记对两系杂交稻两优培胜的种子纯度进行了鉴定，结果与田间种植鉴定的结果完全吻合。曾大力等［５］对湖北省某公证处封存的２份杂交稻材料进行了真假鉴定，结果显示２份材料的微卫星指纹差异明显。肖小余等［６］利用ＳＳＲ标记对四川省主推杂交稻品种进行了指纹图谱构建及品种鉴定，从指纹数据库中筛选出了用于Ｄ优５２７纯度及真伪鉴定的特异引物。詹天才［７］利用ＳＳＲ标记对杂交稻种子进行了纯度鉴定，用两对多态性引物分别对掺假的威优４６和金优２０７两个品种分别进行纯度鉴定，结果发现两者都能有效地将掺入组合中的假种子区分开。彭锁堂等［８］利用ＳＳＲ引物构建了９个杂交稻组合亲本的指纹图谱，组合纯度鉴定表明分子标记纯度鉴定与田间种植鉴定结果无显著差异。
　　研究选取分布于水稻１２条染色体上的ＳＳＲ引物１１２对，对重庆市常用杂交稻亲本进行多态性分析，并构建指纹图谱，以期为杂交稻品种的真伪及纯度鉴定等提供分子水平的依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　杂交稻亲本共１２份，包括６份不育系（中九Ａ、Ｋ１８Ａ、协青早Ａ、金２３Ａ、川香２９Ａ、宜香１Ａ）及６份恢复系（万恢８８、辐恢８３８、蜀恢５２７、绵恢７２５、万恢６４６、万恢３５５）。纯度鉴定材料为万优２号（宜香１Ａ／万恢３５５）和Ｋ优８８（Ｋ１８Ａ／万恢８８）。
　　１．２ＤＮＡ提取
　　取杂交稻亲本种子各２０粒左右，杂交种万优２号和Ｋ优８８各５００粒，单独浸种并催发幼苗，待幼苗生长到约５ ｃｍ时取单粒苗分别提取ＤＮＡ，ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法［９］。
　　１．３ＰＣＲ扩增
　　引物序列来自网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｓａｔ），由上海英骏生物技术有限公司合成。ＰＣＲ仪为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ。２５ μＬ的反应体系中包括：１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ值８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１ＵＴａｑ酶，４ ｎｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１０ ｐｍｏｌ／Ｌ引物，２０ｎｇ模板ＤＮＡ。ＰＣＲ程序为：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃复性３０ ｓ，７２℃延伸４５ ｓ，３５个循环；７２℃再延伸１０ ｍｉｎ。每管反应产物中加入２ μＬ溴酚蓝（含０．２５％溴酚蓝和４０％蔗糖水溶液），再用３％的琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后于凝胶成像系统上观察记录。
　　１．４数据处理
　　选取扩增效果好的引物进行数据统计。每对ＳＳＲ引物检测一个位点，视每对ＳＳＲ引物扩增产物中具有相同电泳迁移率的一条多态性条带为一个等位基因，并将清晰条带赋值为“１”，无条带赋值为“０”，构建亲本指纹数据库。ＳＳＲ标记进行纯度鉴定时，真杂交种应同时具有双亲电泳谱带，只具一个亲本电泳谱带的均视为杂株。
　　１．５田间纯度鉴定
　　２０１０年于重庆三峡农业科学院高峰试验基地种植杂交稻万优２号及Ｋ优８８各１ ０００株，试验设３次重复。田间管理同大田生产，观察植株形态并鉴定其纯度。
　　２结果与分析
　　２．１１２份杂交稻亲本的指纹图谱构建
　　选取分布于水稻１２条染色体上的１１２对ＳＳＲ引物，对１２份杂交稻亲本进行多态性分析，筛选出具有多态性的引物３５对，占所用引物的３１．２５％，每对引物检测到的等位基因数为２～４个。选取多态性较好的２５对引物构建指纹图谱，２５对引物的特异条带组合构成一个亲本材料的指纹，该指纹可用于相应杂交稻组合的真伪及纯度鉴定。
　　２．２万优２号及Ｋ优８８的特异引物筛选
　　万优２号的亲本宜香１Ａ与万恢３５５之间有１３对条带清晰、多态性好的ＳＳＲ引物（图１）。其中ＲＭ１７可以将宜香１Ａ与其他所有材料区分开，ＲＭ２５２和ＲＭ２３７可以将万恢３５５与其他恢复系区分开，这3对引物构成万优２号及其亲本的特异引物。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　Ｋ优８８的亲本Ｋ１８Ａ与万恢８８之间有９对多态性好的ＳＳＲ引物（图２）。ＲＭ１、ＲＭ１４４可以将Ｋ１８Ａ与其他不育系区分开，ＲＭ２１３和ＲＭ３４１可以将万恢８８与其他恢复系区分开，这４对引物构成Ｋ优８８及其亲本的特异引物。
　　２．３万优２号和Ｋ优８８纯度鉴定
　　利用亲本差异引物ＲＭ１７和ＲＭ３４１分别对杂交种万优２号与Ｋ优８８进行纯度鉴定。３００个单株中，万优２号共检测出杂株１１株，杂株率为３．６７％；Ｋ优８８共检测出杂株１３株，杂株率为４．３３％（图３）。两者田间鉴定检出杂株率分别为２．４０％和３．４０％，两种鉴定方法所得结果比较吻合，说明ＳＳＲ标记纯度鉴定与田间鉴定具有较好的一致性。
　　３讨论
　　利用ＳＳＲ分子标记构建杂交稻亲本指纹图谱后，可从中寻找相关杂交稻组合的特异引物，并用于该组合杂交种子的纯度及真伪鉴定。研究利用多态性较好的２５对ＳＳＲ引物构建了１２份杂交稻亲本的指纹图谱，从指纹数据库中筛选出杂交稻万优２号和Ｋ优８８亲本的特异引物，并对两组合的杂交一代种进行了纯度鉴定。结果表明，田间鉴定与ＳＳＲ标记鉴定结果无明显差异，说明利用ＳＳＲ分子标记进行杂交稻种子纯度鉴定结果准确可靠。比较而言，田间纯度鉴定容易受到气候等外界条件的影响，且费时费力；利用ＳＳＲ标记进行纯度鉴定则可以完全在实验室内完成，受外界条件影响较小，并且其重复性好、操作简单、用时短，研究从催发幼苗到完成ＰＣＲ共耗时１０ ｄ。
　　利用引物ＲＭ３４１对Ｋ优８８进行纯度鉴定时，杂交种除出现双亲的互补带型外，还有一条较弱的第三条电泳带。辛业芸等［１０］认为，此种电泳带的产生是由于杂交种的杂合链所致。如果这种电泳带的确由杂交种的杂交链所产生，则可以进一步加强ＳＳＲ标记鉴定的可信度。因为只有真杂交种才可能产生杂交链，产生了杂交链才会出现除双亲互补带型以外的第三条电泳带。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 李云海，肖晗，张春庆，等．用微卫星ＤＮＡ标记检测中国主要杂交水稻亲本的遗传差异［Ｊ］．植物学报，１９９９，４１（１０）：１０６１－１０６６．
　　［２］ 郭慧，李树杏，徐建第，等． ２４份水稻细胞质雄性不育系的ＳＳＲ多态性分析［Ｊ］．杂交水稻， ２００７，２２（３）：５６－６１．
　　［３］ 姜树坤，王政海，钟鸣，等．辽宁省近十五年部分主栽水稻品种的ＳＳＲ多态性分析［Ｊ］．植物生理学通讯，２００７，４３（１）：６９－７２．
　　［４］ 李进波，牟同敏，夏建武，等．利用微卫星标记鉴定两系杂交稻两优培胜的种子纯度［Ｊ］．中国农学通报，２００２，１８（６）：１０－１３．
　　［５］ 曾大力，钱前，何平，等．利用分子生物学技术鉴别真、假杂交稻的研究［Ｊ］．中国农业科学，１９９９，３２（２）：９３－９６．
　　［６］ 肖小余，王玉平，张建勇，等． 四川省主要杂交稻亲本的ＳＳＲ多态性分析和指纹图谱的构建与应用［Ｊ］． 中国水稻科学，２００６， ２０（１）：１－７．
　　［７］ 詹天才．利用微卫星ＤＮＡ标记进行杂交水稻种子纯度鉴定的研究［Ｊ］．杂交水稻，２００２，１７（５）：４６－５０．
　　［８］ 彭锁堂，庄杰云，颜启传，等．我国主要杂交水稻组合及其亲本ＳＳＲ标记和纯度鉴定［Ｊ］．中国水稻科学，２００３，１７（１）：１－５．
　　［９］ ＭＵＲＲＡＹ Ｍ Ｇ，ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｗ Ｆ． Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８０，８（１９）：４３２１－４３２５．
　　［１０］ 辛业芸，张展，熊易平，等．应用ＳＳＲ分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度［Ｊ］．中国水稻科学，２００５，１９（２）：９５－１００．
　　
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