DNA多态【不同基因组野生稻随机微卫星扩增多态ＤＮＡ（ＲＭＡＰＤ）遗传分析】

　　摘　要：采用32对RMAPD引物对水稻9种类型基因组的44份材料遗传多样性进行研究，PCR产物经凝胶电泳后进行带型统计并用NT3YS软件进行聚类分析，结果显示44份材料可分为AA基因组和其他基因组2个人组，其他基因组可分为BCD、EFG和HJ等3个小组；BCD小组聚类结果表明CC基因组与BBCC基因组关系亲缘最近，与CCDD基因组次之，而与AA基因组最远，结果同时表明，AA基因组野生稻和非AA基因组野生稻含丰富的栽培稻所没有的基因，RMAPD标记在群体遗传结构和亲缘关系分析等水稻遗传育种领域具有广阔的应用前景。
　　关键词：野生稻；基因组；RMAPD；遗传多样性
　　中图分类号：Q943　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0248－05
　　
　　野生稻长期处于野生状态，经受各种灾害和不良环境的自然选择，拥有丰富的基因库，保存着栽培稻不具有或消失了的特异基因，其遗传多样性远远高于栽培稻，挖掘野生稻优秀基因的研究日益受到重视，近年来从野生稻中筛选出有效基因转入栽培稻中，使栽培稻具有野生稻的高产、抗褐飞虱、抗白叶枯病等性状的研究有了很大的发展，从野生稻中搜寻和克隆优良基因并转入栽培稻中在育种中应用逐渐成为育种家的研究新方向。
　　在水稻中应用的分子标记很多，从较早应用的RFLP、RAPD和AFLP等标记到现在常用的SSR和ISSR等，这些分子标记在研究水稻的多态性、构建分子图谱、基因的定位与克隆、种子纯度鉴定、品种的鉴定和育种等方面有广泛的应用，各种分子标记都有自己的特点，但RFLP、RAPD和AFLP重复性差，结果不够稳定；SSR多态性不够；ISSR多态性较SSR丰富，但稳定性也不够，且主要扩增的是非编码区。
　　RMAPD标记采用随机引物和微卫星的上游或下游引物一起作为一对扩增引物，该标记不仅具有RAPD标记的多态性同时还具有SSR标记的稳定性，在群体遗传结构和亲缘关系分析以及标记辅助选择等领域具有广泛的应用前景，该标记是一种新的分子标记。目前主要应用在动物中，在植物中应用很少，本研究应用此标记对不同基因组野生稻进行分析，为野生稻的分类、不同基因组野生稻的亲缘关系提供分子依据，并期待能在育种中得到应用。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料
　　AA基因组材料20个(包括栽培稻4个、陆稻1个、爪哇稻2个、普通野生稻12个，尼瓦拉野生稻1个)，BBCC基因组2个，CC基因组材料6个，CCDD基因组材料8个，EE基因组材料3个，HHJJ基因组材料2个，BB、FF和GG基因组材料各1个，共计44个材料(表1)。
　　
　　1．2　方法
　　
　　1．2．1　引物
　　RAPD引物参考文献[2]，SSR引物选自www.省略(表2)，从中随机抽取RAPD引物和SSR引物进行配对试验，筛选出扩增效果好、多态性强的的引物32对。
　　
　　1．2．2　DNA提取采用略做改进的CTAB法提取基因组DNA。
　　1．2．3　RMAPD反应体系
　　2.5μL 10*PCR Buffer，0.5μL 2OD SSR引物，1.0μL 2OD RAPD引物，0.3μL140mmol/LdNTPs，1U Taq，40ng Template，补充超纯水至总体积25μL。
　　1．2．4　RMAPD反应程序
　　95℃预变性4min→36个循环(94℃变性30s→X℃退火30s→72℃延伸45S→94℃变性30s→36℃退火60s→72℃延伸90s)→72℃最后延伸10min(注：X℃为不同微卫星引物的退火温度)。
　　1．2．5　RMAPD产物电泳检测及数据分析
　　产物在3％琼脂糖电泳检测，然后在Gel-Logic 100 Image System上凝胶成像，将成像的条带按有无分别赋值1和0，转换为数值矩阵，然后用NTSYS2，10e软件进行遗传距离计算并构建系统树。
　　
　　2　实验结果
　　
　　2．1　不同基因组野生稻RMAPD遗传多样性分析
　　32对RMAPD引物在44份不同基因组材料中共扩增带533条，平均每对引物扩增16.66条，其中多态性带522条，比例为97.85％，不同基因组材料多态性以AA基因组相对较高(表3)，20个材料平均多态性带为13.89条：CC基因组和CCDD基因组分别为11.50条和11.75条，EE基因组材料较少，平均每个材料为10.33条，这与郑景生13)等运用SsR分子标记对野生稻不同基因组多样性分析的结果一致，AA基因组材料是遗传多样性比较丰富的基因组类群。
　　
　　把材料分为AA基因组和非AA基因组野生 稻进行遗传多样性比较(表4)，AA基因组材料比 非AA基因组野生稻的特异带和平均特异带明显 偏少，说明非AA基因组野生稻具丰富的AA基 因组材料没有的基因片段，具有较大的遗传多样 性差异。
　　
　　2．2　不同基因组野生稻聚类分析
　　应用NTSYS软件对基于32对RMAPD标记数据的不同基因组野生稻进行了聚类分析，并绘制了树状图(图1)，44份不同基因组材料分为2个大组。
　　第1大组为AA基因组的20个材料，包括4个栽培稻、12个普通野生稻、2个爪哇稻、1个陆稻和1个尼瓦拉野生稻，4个栽培稻聚为1小类，且籼稻和粳稻材料单独成小支，12个普通野生稻中位于北纬20°～26°之间的海南普通野生稻、合浦普通野生稻、柳江普通野生稻、桂林普通野生稻、扶绥普通野生稻、田阳普通野生稻、公馆普通野生稻、增城普通野生稻和江永普通野生稻等9个材料聚为1类，而处于北纬26°～28°之间的茶陵普通野生稻、安仁普通野生稻和东乡普通野生稻等3个材料又为1类。这样的聚类结果说明AA基因组的野生稻材料分布可能与纬度有一定的关系，2个爪哇稻材料成1小支，与陆稻优先聚类，再与栽培稻聚类。尼瓦拉野生稻在最外层，这1大组中，栽培稻与普通野生稻优先聚类，然后再与其他材料聚类，这说明了栽培稻与普通野生稻有较近的亲缘关系。
　　
　　第2大组为其他基因组，包括BCD、EFG和HJ等3类，BCD类则包括BB、BBCC、CC和CCDD等4个基因组的野生稻，其中BBCC基因组的2个材料与CC基因组的5个材料优先聚类，然后再与BB基因组材料聚类，这说明BBCC基因组与CC基因组亲缘较近，与BB基因组稍远。与CCDD基因组则更远，EFG类群中包括EE基因组的澳洲野生稻与FF基因组的短花野生稻和GG基因组的疣粒野生稻，GG基因组与PP基因组优先聚类，再与EE基因组聚类，HJ类群为HHJJ基因组的马来野生稻，单独为一小类群。 　
　　3　讨论
　　
　　亚洲栽培稻起源于普通野生稻，普通野生稻的籼粳分化一直是研究热点，Morishima通过同工酶和形态性状分析，认为大多数普通野生稻介于典型籼稻和粳稻之间，中国普通野生稻主要偏粳和籼粳中间型，南亚偏籼：才宏伟的同工酶研究表明，中国普通野生稻偏籼和偏粳都有；本研究中普通野生稻材料与典型籼粳特异性带进行对 比，各普通野生稻都存在籼粳特异带，有的偏籼比例较高，有的偏粳比例较高；朱世华等检测到普通野生稻(AA基因组)的rDNA间隔区长度变异类型的地理分布与纬度有关，高纬度来源的普通野生稻的rDNA间隔区长度较短。低纬度来源的普通野生稻的rDNA间隔区长度较长，黄光文运用SSR和ISSR标记对部分普通野生稻的研究认为，低纬度的普通野生稻籼型成分比高纬度的要多，本文的研究结果认为AA基因组的普通野生稻起源可能和纬度有关，可以依据纬度把普通野生稻分为低纬区野生稻和高纬区野生稻，同时结果还认为普通野生稻比同AA基因的栽培稻有更多的基因，非AA基因野生稻又含有AA基因组野生稻没有的基因，这表明野生稻是一个很大的“基因库”，栽培稻在驯化过程中很多基因丧失，栽培稻的资源利用率已经很高了，要想进一步提高产量。不得不考虑栽培稻外的资源，而野生稻有着如此多的栽培稻所没有的基因，这说明野生稻在育种方面大有潜力可挖。
　　卢宝荣等把野生稻分为AA+BCD、FF和其它为一组的两大组：张乃群等，认为野生稻分为AA、BCD和其余的为一组等3组；郑景生等则认为不同基因型野生稻可分为AA+BCD、FF+GG和HHJJ等3大组，由此可见对于野生稻进行大组归类时，不同基因组的归组问题仍然有不同的看法，本研究直接把不同基因组材料分为了两个大组：AA基因组和其他基因组，其他基因组再包括几个小组，Nayar在总结稻属染色体组间关系时指出，A染色体组和C染色体组是公认的基本染色体组，B、C和D染色体组彼此间有一定的关系，E、F染色体组和其他染色体组的关系不清楚；Wang等采用核DNA限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究了稻属21个种的亲缘关系，在单独探讨二倍体亲缘关系时，结果是E染色体组明显位于C染色体组和B染色体组共同的分支之外，显示E染色体组和另两个染色体组间较远的关系；包颖等对叶绿体matK基因、nrDNA ITS片段、低拷贝核基因Adhl和Adh2进行序列分析，得出C染色体组和B染色体组的亲缘关系要比它们和E染色体组的更近，本文研究结果表明A染色体组是基本染色体组之一，C染色体组位于其他染色体组的核心位置，分组时C染色体组位于基部，其他染色体组则由此展开，由此也说明了A染色体组和C染色体组是基本染色体组；实验结果还说明了EE染色体组与GG和FF染色体组亲缘较近，与BC染色体组亲缘则相对较远。
　　
　　作者简介：陈觉梁(1982－)，男，湖南常德人，硕士研究生，主要从事植物发育与分子生物学研究；陈良碧(1956－)，男，湖南沅陵人，湖南师范大学教授，博士生导师，通讯作者，主要从事植物发育与分子生物学研究。