体细胞巨染色体制片与观察【不同制片方法对草莓染色体观察效果的影响】

　　摘 要：通过在草莓根尖、茎尖和嫩叶等不同部位进行取材，然后经过不同的制片过程,进行了染色体数目观察方法的研究。结果表明：取材部位以根尖效果最好；不同的制片方法中，以用对二氯苯饱和水溶液进行预处理2～3 h（小时），改良的卡诺氏固定液固定2 h（小时），1 mol/L的HCl于60 ℃下解离10 min（分钟），并以改良的卡宝品红染色效果较好。同时探讨了影响草莓染色体观察的因素。�
　　关键词：草莓；染色体观察；制片方法
　　
　　草莓属植物约有50个种，我国草莓生产所用品种都为国外引入或利用少数国外引进品种杂交而得，栽培草莓遗传背景狭窄影响了我国草莓的品种改良。我国野生草莓种质中蕴藏着香气独特、四季结果、休眠浅、抗逆境及病虫害等优良性状，这些种质资源可以作为栽培种凤梨草莓改良的重要材料。若能将这些野生种质的优良性状基因导入凤梨草莓，对我国草莓品种的改良和草莓生产无疑具有十分重要的意义及价值。本试验通过对草莓野生种和草莓栽培种染色体数目观察，试图找到一种适宜草莓染色体观察记数的方法，为草莓性状改良提供理论依据。�
　　
　　1 材料与方法�
　　
　　1.1 试验材料�
　　本试验所用的试验材料栽培草莓品种为全明星，野生草莓为五叶草莓（Fragaria.pentaphylla Lozinsk），分别于2006年11月份和2007年2月份种植于山东果园试验田中。在3~5月期间，曾采用小拱棚保温保湿，进行促成栽培。 �
　　1.2 试验方法�
　　本试验采用常规压片法对草莓染色体的数目进行观察，并对好的细胞分裂相进行拍照。处理的具体步骤如下（以下同一试验步骤中有不同取样或处理为交叉试验）：①取材。取草莓的根尖、茎尖和幼叶用自来水洗2～3次。 ②预处理。即将洗净的草莓材料从母体上切割下来，放在吸水纸上吸去多余的水分后，直接放入预处理液对二氯苯饱和水溶液和秋水仙素水溶液中处理2～3 h（小时），然后用蒸馏水换洗3～5次。③固定。分别用卡诺氏固定液和改良的卡诺氏固定液对预处理材料进行固定，固定好后用蒸馏水换洗3～5次。④解离。先用1 mol/L的盐酸在60 ℃恒温水浴锅内处理，处理时间分别为5 min（分钟），10 min（分钟）和15 min（分钟）；处理好后再用蒸馏水换洗3～5次。⑤酶解。本试验分不酶解和用2 %的纤维素酶处理1 h（小时）两种方法；酶处理之后，用蒸馏水稍加洗涤，然后用固定液重新固定；固定好后用蒸馏水换洗3～5次。⑥染色。分别采用改良的卡宝品红染色和乙酸洋红对材料进行染色。⑦压片。材料置洁净的载片上，加约�1/3�滴的染色液，用镊子的基部将材料充分压碎，并使其分散均匀，加盖片。静置片刻，在盖片左下角放一硬纸片，并用左手食指压紧，以防盖片错动。右手用解剖针平头部分轻轻敲击盖片，使细胞均匀分散。然后，用平头一端由盖片四周向中央先轻后重的敲击，使细胞压平。最后，在盖片上加吸水纸，置平整的桌面或玻璃板上，用大拇指紧压即可。⑧镜检。先用低倍镜观察，发现好的分裂相后，再逐渐转移到油镜下仔细观察记数。�
　　
　　2 结果和分析�
　　
　　2.1 草莓及五叶草莓的染色体数目�
　　通过对栽培草莓及野生五叶草莓染色体数目进行观察，可以初步确定栽培草莓为8倍体（图1），野生五叶草莓为2倍体（图2）。本试验的结果与葛会波，雷家军等的研究结果相符合。�
　　2.2 取材部位对草莓染色体观察效果的影响�
　　原则上讲，凡是进行细胞分裂的分生器官、组织甚至单个细胞，都可用于进行染色体观察。
　　
　　但在具体实践中，常因取材不当而导致失败。本试验结果表明，进行草莓染色体观察时，根尖取材方便，分生区集中而容易判断，此外，也不受季节的影响。草莓根长1.5～2.5 cm时，细胞分裂指数最高，取材最适宜。草莓的茎尖和幼叶作为观察染色体的材料效果比根尖差的多。这是因为茎尖和幼叶的取材受到生长季节的限制，其次是其细胞分裂指数一般较根尖低。又由于有不同的非分生细胞或贮藏物或分泌物的干扰，因此，通常不适于用压片法制片观察染色体。�
　　2.3 取材时间对草莓染色体观察效果的影响�
　　试验的结果表明，草莓取材的最佳时期是早上9：00～9：30，特别是雨后第2天晴天的上午，根尖中细胞分裂相最多，也可以头天浇水第2天取材。这可能是由于早上草莓生长较快，其细胞分裂旺盛的缘故。�
　　2.4 不同预处理试剂对草莓染色体观察效果的影响�
　　试验的结果表明，若材料不经过预处理，不仅其细胞分裂指数偏低，而且也不适宜于直接作染色体记数，而经过预处理后效果要好的多。通过预处理药品效果对比试验发现，用对二氯苯饱和水溶液进行预处理2~3 h（小时）效果较好，且经济成本低。经此药物处理后，草莓染色体易于分散，因而适用于对染色体的计数研究。但经处理后的草莓染色体，显示缢痕则没有其他药物处理清晰。处理的温度以10 ℃～20 ℃为宜，高温往往易于诱发染色体发生粘连。 用秋水仙素对草莓材料进行预处理，因它对不同的材料如草莓根尖和茎尖，其最适浓度和处理的持续时间不同。所以，常需进行多次试验，才能找出最佳浓度和最佳的处理持续时间，这是其不便之处。�
　　2.5 不同固定液对草莓染色体观察效果的影响�
　　固定的目的，一是利用化学药物将生活细胞迅速杀死，使蛋白质变性和沉淀，以保持染色体的固有形态和结构；二是可增加细胞的透性和易于染色。试验结果表明，改良的卡诺氏固定液比卡诺氏固定液效果好，且可缩短处理的时间，用改良的卡诺氏固定液固定2 h（小时）左右即可。固定时间长效果反而不好。卡诺氏固定液由3份95 %乙醇和1份冰乙酸组成，而改良的卡诺氏固定液由5份95 %乙醇、3份冰乙酸和2份三氯甲烷组成。改良的卡诺氏固定液加大了冰乙酸的用量，其作用是保证染色体的充分固定。另外，加入少量的三氯甲烷，其作用是提高固定液的脂溶性能，还可以破坏类脂性的线粒体和高尔基体，以增加细胞的透明度。由于乙醇是还原剂，易于氧化成乙醛甚至乙酸，改变固定液的特性，此外固定液还可提取部分或大部分染色体中的组蛋白。因此，固定的时间不宜过长。�
　　2.6 不同解离时间对草莓染色体观察效果的影响�
　　试验结果表明，用1 mol/L的HCl在恒温水浴锅内60 ℃条件下解离，草莓根尖以处理10 min（分钟）为宜。处理时间过长或过短效果都不好。解离的作用是除去细胞之间的果胶层并使细胞壁软化，以利于压片。根据多次的试验经验，我们发现HCl的水解时间与染色液的染色质量密切相关。当水解时间不足时，细胞质也着色，使反差降低。水解时间过长，细胞质虽不着色，但染色体的染色浅、淡。只有在水解时间适宜时，才可获得染色的最佳效果，即染色体呈深红或紫红色，细胞质无色或只有极淡的红色。�
　　2.7 不同染色液对草莓染色体观察效果的影响�
　　试验结果表明，草莓材料采用改良的卡宝品红染色比用乙酸洋红的染色效果要好。改良的卡宝品红染色既具有分色清晰的优点，又具有乙酸洋红染色的操作简便、快速的特点。此外，染色剂的耐保存和稳定性以及制片后颜色的耐久不褪色等优点，都是乙酸洋红法所不及的。材料经HCl水解后，务必将HCl用水彻底洗净后，方可染色。否则，将不易染色。�
　　2.8 酶处理对草莓染色体观察效果的影响�
　　试验结果表明，对草莓染色体观察来说，酶处理不是一个必须的步骤，材料经HCl水解后，便可直接用卡宝品红染色和压片。但草莓的染色体较小，若想获得具有清晰缢痕的染色体制片时，酶解离则是一个非常必要的步骤。因为酶解离之前已经过HCl水解，细胞壁之间的中层果胶类物质已被HCl水解，所以一般只需用纤维素酶处理即可。酶解离的作用是消化细胞壁上的部分纤维素，如用2 %的纤维素酶处理约1 h（小时）即可。酶处理之后，用蒸馏水稍加洗涤，再用固定液重新固定，一则使酶失活，二则使染色体适度硬化。�
　　2.9 压片技术对草莓染色体观察效果的影响�
　　根据试验结果认为，加约1/3滴的染色液即可，切不可多加，否则细胞很容易随多余的染色液流出盖片外。另外，还发现将玻片置酒精灯上微热，可使细胞进一步软化和增强染色。 �
　　
　　3 结论�
　　
　　1）在草莓染色体观察中，取材部位以根尖效果为最好；�
　　2）不同的制片方法中，以由对二氯苯饱和水溶液进行预处理2～3 h（小时），改良的卡诺氏固定液固定2 h（小时），1 mol/L的HCI于60 ℃下解离10 min（分钟），并以改良的卡宝品红染色效果较好。�
　　
　　参考文献�
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　　第一作者简介：齐秀玲（1974-），女，广西大学农学院在读硕士，农艺师。�
　　（收稿日期：2007�06�05）