[人干扰素ＩＦＮα－２ｂ在果蝇细胞中的稳定表达]重组干扰素a2b软膏用法

　　摘要：以人干扰素IFN-2b全长基因的质粒为模板，PCR扩增，PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒，经转染和筛选，得到稳定表达的果蝇S2细胞株，经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测，结果显示，在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达，表达产物的大小约为26kD,并且，通过体外的抗病毒活性测定，证明所表达蛋白具有抗病毒活性，该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白，研究其结构和功能提供了重要的基础。
　　关键词：人干扰素IFNα-2b；果蝇S2细胞；果蝇表达系统；稳定表达
　　中图分类号：R373
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)02-0143-04
　　
　　干扰素(Interferon，IFN)是对病毒感染和其它抗原刺激应答所产生的一组宿主蛋白，根据产生干扰素细胞来源不同，理化性质和生物学活性的差异，可分为α，β，γ 3类，分别属于I型(α、β)和II(γ)型干扰素，目前认为I型(α、β)型干扰素的抗病毒作用优于II(γ)型干扰素，而II(γ)型干扰素的抗肿瘤及免疫调节功能优于I型(α、β)型干扰素，果蝇s2细胞系来源于黑腹果蝇(Droso-ohila melanogaster)晚期胚胎的培养物，该细胞系的许多特征揭示其来源于巨噬细胞样细胞系，果蝇S2细胞可在28℃或室温无CO2条件下生长，其在组织培养瓶中以松散，半贴壁的单层状态生长或在摇瓶中以悬浮状态生长，
　　果蝇表达系统(Drosophila expression system)DES包含表达载体(pMT/BiP/V5-His A)和相应的选择载体(pCoHygro)，通过表达载体和选择载体的共转染，可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系，而且通过优化表达载体和选择载体的比例，可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系，从而提高目的蛋白的表达量。
　　人干扰素IFNα-2b具有许多生物学作用，包括广谱的抗病毒作用，抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫的功能，这些使得它成为治疗肿瘤性疾病，癌症和肝炎的潜在制剂，干扰素制剂有自然的和重组的两类，临床应用的干扰素主要是从大肠杆菌中获得的基因重组蛋白，而果蝇表达系统是非常出色的真核表达系统，有许多独特的优势，如比哺乳动物表达系统更高的表达量，简单的高密度细胞培养，可减少降解的分泌性表达等，我们尝试研究一下干扰素在这一系统中的表达情况。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1果蝇S2细胞系(Schneider 2 Cells)，Wish细胞和VSV病毒
　　果蝇S2细胞系由健康科学研究所戈宝学研究员惠赠，用DES完全培养液培养于28℃无CO2的细胞培养箱中，其中DES完全培养液的构成为：DES培养液(HyClone公司)，10％胎牛血清(Gibco公司)，2mmol/LL-谷氨酰胺(Calbiochem公司)，100U/mL的青霉素和0.1g/L的链霉素。
　　DES Expression Vectors包含将感兴趣的目的基因克隆进去的表达载体(Expression vector)pMT/BiP/V5-HisA和一个相关的选择载体(Se-lection vector)pCoHygro，这些载体购自Invitrogen公司。
　　Wish细胞和VSV病毒由上海复兴公司提供，Wish细胞的培养条件是，用含10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI－1640(HyClone公司)培养液培养于37℃有CO2的细胞培养箱中，干扰素的标准品由上海复兴公司提供，以用作抗病毒活性测试中的对照。
　　其它主要试剂：小量质粒抽提及胶纯化回收试剂盒购自Qiangen公司，rr4 DNA连接酶及限制性内切酶EcoR I，Not I购自Takara公司，一抗小鼠抗人IFNα的单克隆抗体购自R&D公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自Sigma公司。
　　
　　1.2人干扰素IFNα-2b表达载体的构建
　　含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒由上海志壮生物科技有限公司合成，为克隆至pMT/BiP/V5-His A表达载体，根据IFNα-2b基因序列，设计了两个引物，分别是：5′端GTGGAATTC-TATGTGTGACT-FGCCACA(斜体为引入的酶切位点EcoR I),3"ATAGCGGCCGCAACTCCTFAGATCTCAAAGA(斜体为引入的酶切位点Not I)，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，
　　以含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板，PCR扩增，PCR产物克隆到pMT/BiP/V5-His A获得重组质粒pMT/BiP/V5-His A-IFNα-2b。
　　
　　1.3果蝇S2细胞的稳定转化与筛选
　　果蝇S2细胞的转化方法部分参照文献，吸取含3×106 S2细胞的完全培养液，接种于35mm细胞培养板，28℃无CO2培养6～16h，直到细胞达到对数生长期(2～4×106/mL)，对于每一个35mm细胞培养板，准备转染试剂如下：A液(2mol/LCaC|236μL，重组DNA　19μg，pCoHygro 1μg，加去离子水至300μL)，B液(300μL 2xHBS)，逐滴缓慢将A液加入B液中，并持续摇动混匀，将所得溶液于室温孵育30～40 min，至形成沉淀，混匀溶液并逐滴加人细胞培养板中，28℃无CO2培养16～24h。
　　为筛选得到果蝇s2细胞稳定转染的细胞系，先去除磷酸钙，并用完全培养基将细胞洗两次，离心，重悬细胞于含300 mg/L抗生素HygromycinB的新鲜培养液中，28℃培养，每4～5d更换抗性培养液，直到抗性细胞克隆产生(需3～4周)。
　　
　　1.4诱导表达与Western-blotting分析
　　稳定表达的细胞系建立后，使用第3代细胞诱导表达，加入硫酸铜至终浓度为500μmol/L24h后收获细胞，收集细胞培养上清，经真空低温浓缩后，对表达产物进行Western blotting分析
　　参照Bio-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测，将丽春红染色后的PVDF膜(Millipore公司)转移至封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液)中，室温轻摇1～2 h后4℃封闭过夜；倒掉封闭液，用TBST(100 mmol/LTris-HCl，pH 7.5，150mmol/LNaCl)洗膜3次，每次10min，然后加入以封闭液1：1000稀释的一抗，室温下震荡1～1.5h；再用TBST洗膜3次，每 次10min，然后加入以封闭液1：5000稀释的二抗，室温下震荡1～1.5 h；再用TBST洗膜3次，每次10min，最后用ECL(Pie0rce公司)显色，在x光胶片上曝光，显影和定影观察，
　　
　　1.5体外抗病毒效价测定
　　VSV病毒的繁殖及效价的测定方法参照文献描述，VSV病毒经1：10稀释后接种于形成单层的Wish细胞，37℃培养24～48h，待细胞出现病变(CPE)达+++～++++时收获，于-20℃冻存；采用常用的微量细胞病变法测定病毒的效价，其效价(TCID50)为10-6／mL；“+”为25％细胞出现CPE，“++”为50％细胞出现CPE，“+++”为75％出现CPE，“++++”为100％细胞出现CPE。
　　取干扰素标准品一支，稀释成500IU／mL，然后依次对倍稀释加人96孔板中，每孔100μL，每个稀释度设3个复孔，表达的果蝇S2细胞上清也进行对倍稀释，每孔100μL。
　　然后在各孔中均加人100μL(2×105/mL)Wish细胞，37℃，5％CO2培养6h后，加人100TCID50的VSV病毒100μL，并设有细胞对照和病毒对照，其中细胞对照不加病毒液，病毒对照不加IFN，待细胞对照正常而病毒对照孔内出现+++～++++CPE时，进行效价判定。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1人干扰素IFNα-2b果蝇细胞表达载体的构建
　　人干扰素IFNα-2b全长基因经PCR扩增，PCR产物及空表达载体pMT/BiP/V5－His A经EcoR I，Not I酶切后，回收、连接、转化感受态细胞、抽提质粒，经酶切鉴定得到重组质粒pMT/BiP/V5－His A-IFNα-2b，其中人干扰素IFNα－2b基因为498 bp，载体pMT/BiP/V5－HisA为3600 bp，然后进行测序，测序结果表明获得的重组表达载体的序列和插入方向完全正确。
　　
　　2.2表达蛋白的免疫印迹分析
　　果蝇S2细胞稳定转染细胞系经扩增和硫酸铜诱导表达24h后，收集细胞培养上清3mL，经真空冷冻浓缩至100μL后，对表达产物进行Western blotting分析，蛋白转印后，免疫印迹分析结果表明：表达蛋白能被小鼠抗人IFNα的单克隆抗体特异性识别，证明表达产物具有良好的免疫学活性。

　　2.3体外抗病毒效价测定
　　根据干扰素活性单位的定义以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位，表1结果显示表达的rhlFNot-2b具有抗病毒活性，然而其活性比标准品低8倍，根据该图表，100μL rhlFNa-2b溶液的抗病毒活性是8Iu，所以表达的rhlFNot-2b的抗病毒活性约是80IU/mL，
　　
　　3讨论
　　
　　果蝇S2细胞系是理想的用于表达的细胞系，首先，非常适合低耗费而高水平的表达真核细胞蛋白，这是因为如下一些原因：在无CO2和无血清条件下高密度培养；所产生的蛋白有真核细胞的翻译后修饰；基因组可整合多拷贝的表达质粒，能够选择出高表达的多克隆稳定细胞系，其次，内源性表达的果蝇细胞蛋白不与哺乳动物细胞蛋白相互作用，提供了蛋白功能研究的空白背景，
　　果蝇表达系统结合了哺乳动物表达系统和昆虫表达系统的优秀特征，使得融合蛋白的表达变得简单高效，该表达系统主要提供了如下的便利：直接产生稳定且高水平表达所需蛋白的昆虫细胞系；含有可诱导启动子的载体，非常适合细胞毒性蛋白的表达；果蝇s2细胞，适合简单而高密度的培养。
　　根据国外的研究，有广泛的蛋白应用这一表达系统获得了成功的表达，而这一系统特别适合表达的蛋白包括分泌性蛋白、细胞受体蛋白、酶和细胞毒性蛋白。
　　由于这些优点，果蝇表达系统在国外的蛋白研究中有极为广泛的应用，包括近年的一些蛋白研究，然而中国国内却无相关工作的开展，在本实验中，我们应用这一系统，使人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中稳定表达，并具有抗病毒活性，这为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白，研究其结构和功能提供了重要的基础。