【植物芥子酶研究进展】黑芥子酶

　　摘　要：芥子酶防御系统为白花菜目植物特有，由芥子酶及其底物硫代葡萄糖苷组成，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，在受到病虫侵袭时，底物和酶相遇，硫代葡糖苷被降为有毒化合物，起防御作用，对植物芥子酶防御系统研究进展进行了综述，包括基因家族的结构、基因的表达调控、芥子酶的细胞定位、植物以外其它生物的芥子酶、硫代葡糖苷／芥子酶系统起源进化以及其可能功能等。
　　关键词：芥子酶；硫代葡糖苷；防御；起源进化；细胞定位
　　中图分类号：Q55　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)03-0189-06
　　
　　1　硫代葡糖苷／芥子酶防御系统简介
　　
　　十字花科植物分布很广，一般来说，它们在生物界具有一定生存和扩张的优势，这种优势得益于其独特的硫代葡糖苷／芥子酶体系，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，在必要时，如机械损伤时，底物和酶相遇，硫代葡糖苷被降解为有毒化合物，抵御病虫侵袭，这就是人们所说的“芥子炸弹”，然而，有些害虫(专性昆虫)通过协同进化，已克服了硫代葡糖苷降解产物的毒性，因此，硫代葡糖苷／芥子酶体系的防御功能主要针对兼性昆虫。
　　硫代葡糖苷一方面是十字花科植物的防御工具，另一方面，又对菜籽油的品质和菜籽饼蛋白质的利用有不利影响，如何培育植株高硫而种子低硫的品种引起了油菜育种家的高度重视，硫代葡糖苷的种类很多，已鉴定结构的超过100种，它们的差别在于R-基团的不同，与生氰葡糖苷类似，硫代葡糖苷的侧链也来自氨基酸，芥子酶是专一降解硫代葡糖苷的酶，甘蓝型油菜大约有20～25个这样的基因，目前还不清楚是否存在不同基因编码的酶对底物有不同的要求，但有证据显示，拟南芥的TGG1和TGG2的功能是冗余的。
　　根据油菜(B.napus)和拟南芥芥子酶eDNA推断，芥子酶单体的分子质量为59kD左右，然而，所有植物芥子酶都不同程度糖基化，使芥子酶单体分子质量达到65～75kD，在植物体内，芥子酶一般以二聚体形式存在，分子质量在135～150kD之间，芥子酶的二维结构已得到阐明，它折叠为(α/β)。桶状，与得到详细研究的、来自Trifolium repens的生氰葡糖苷酶的结构非常相似，一般认为，芥子酶起源于生氰葡糖苷酶(eyanogenie glucosidase)，芥子酶(S-β-葡糖苷酶)的一级结构与O-β-葡糖苷酶的一级结构有很高的同源性，尽管还有一些不同意见，一般认为，区别S-β-葡糖苷酶和O-β-葡糖苷酶的有效方法是看该多肽在187位(以S.alba结晶芥子酶为参照)是谷氨酸还是谷氨酰氨，到目前为止，所有芥子酶都是谷氨酰胺残基，而O-β-葡糖苷酶都是谷氨酸残基，谷氨酸残基(酸性氨基酸)是O-β-葡糖苷酶活性中心的重要组成部分，是硫代葡糖苷降解时的质子供体，在芥子酶中，这一位置被谷氨酰胺取代后，酶活性需要低浓度的抗坏血酸来激活，以抗坏血酸作为质子供体，这一变化可能增加了植物对酶的作用的时空调控的机制，对芥子酶的晶体结构分析结果表明，抗坏血酸位于芥子酶的活性中心，可能代替。O-β-葡糖苷酶活性中心谷氨酸残基的酸性基团的作用，然而，当抗坏血酸浓度较高时，反而抑制芥子酶的活性，芥子酶具有较好的热稳定，纯化的酶在4℃保存几个月，酶活性降低很少，有些芥子酶在植物体内还与其它蛋白质结合形成复杂的结构，这些蛋白质包括MBPs(myrosinase-binding proteins)，MyAPs(myrosinase-associated proteins)等，MBP与芥子酶二聚体的形成有关，通过反义RNA技术阻断MBP的合成，所提取的芥子酶主要以单体的形式存在。
　　
　　2　芥子酶基因的表达调控
　　
　　拟南芥曾经被认为仅有3个芥子酶基因即TGGl、TGG2、TGG3，其中，TGG3是不能编码完整芥子酶的假基因，RT-PCR研究结果表明TGGl和TGG2在叶片、子叶、茎、和花器中表达，这一结果也与Xue等人的原位杂交结果，Chad-ehawan等人的Northern blot结果一致，TGG3尽管是假基因，它却在雄蕾和花�特异表达，但是，在拟南芥的种子和根中，却检测不到芥子酶基因的表达，难以理解的是，在拟南芥的种子和根中，有较多的硫代葡糖苷，于是，人们推测，拟南芥可能还有新的芥子酶基因，2001年，德国的一个研究小组自称发现了一个新的芥子酶基因Pyk10，该基因正好在根部特异表达，然而，由于他们没有酶活性实验证据，且该基因编码的蛋白质与O-β-葡糖苷酶更相近，在187位(以S.alba结晶芥子酶为参照)是谷氨酸而不是谷氨酰氨，因此，Pyk10更可能是O-β-葡糖苷酶，近年，通过对拟南芥基因组数据库的搜索，又发现3个核基因，分别命名为了GG4、TGG5、TGG6(Zhang等，待发表)，它们的某些片段的编码产物与芥子酶相似，进一步与芥子酶的cDNA序列比对，找到了它们的大部分编码序列，用RT-PCR和RACE的方法克隆到TGG4、TGG5的全长cDNA，在酵母中表达的TGG4和TGG5重组蛋白具有很强芥子酶活性，而TGG6与TGG3类似，在编码区有移码突变，不能编码完整多肽，这一新家族的基因在DNA序列、基因结构及编码蛋白特性等方面与已知的芥子酶基因有较大差异，乃至以往用已知芥子酶基因的同源序列为探针进行Southern杂交不能检测到它们的存在，用芥子酶通用的抗体进行Western blotting及免疫组织化学研究也不能发现它们的存在，RT-PCR和Real-time PCR研究结果表明，TGG4和TGG5基因仅在拟南芥根部特异表达，在植物其它部位均不表达，而TGGl和TGG2的表达部位刚好相反。
　　由于油菜(Brassica napus)芥子酶基因数量多，基因间同源率高，研究个别基因的组织特异性及诱导型表达难度较大，以基因亚家族为对象的研究较多，Falk，LenmanIn，Andreasson等用Northern blot和原位杂交的方法研究了油菜3个芥子酶基因亚家族MA、MB、MC的表达，与拟南芥不同的是，芥子酶基因在种子中表达，MA组的芥子酶基因主要在种胚特化的芥子细胞(my-rosin cells)中表达，MC组的基因的表达也局限于种胚，在所有的种胚芥细胞中都能检测到MC的转录产物，在种子的发育过程中，MA、MB、MC同步积累，在体细胞胚状体的发育过程中，芥子酶的积累与种子发育中的情况类似，MB亚家族不仅在种子中表达，而且在于叶、叶片、茎、根、及花和角果中表达，MB基因转录水平及酶活性在嫩叶中比老叶中强，这与嫩叶中硫代葡糖苷的含量较高是一致的，然而，在根部，似乎越老的组织芥子酶活性越高。 　　此外，芥子酶基因的表达还受其它物理化学因子的影响，比如，茉莉酸和脱落酸降低芥子酶基因的表达，有些芥子酶基因能被硫酸盐诱导表达。
　　
　　3　芥子酶的细胞定位
　　
　　早在1884年，Heinricher等就在十字花科植物中发现了一些特殊的细胞，这些细胞具有反常的折光性，在形态和尺寸上与邻近的细胞差异明显，用几种染料染色，结果与邻近的细胞的差异也很明显，这些细胞被认为是积累蛋白质的特化细胞一芥子细胞(myrosin cells)，芥子细胞以单细胞形式。分散在根、茎、叶、种子及幼苗中，用米伦试剂(Millon’s reagent)和芥子酶抗体双染色显示，芥子细胞中含有芥子酶，如前所述，原位杂交结果也表明芥子酶基因的转录发生在芥子细胞中，由此推断，芥子酶的合成也在芥子细胞中完成，免疫金粉标记的电镜研究结果显示，芥子酶位于芥子细胞中的一些颗粒结构内部，在油菜种子发育过程中，第一个芥子细胞大约在授粉后20d出现，此后芥子细胞的数量逐渐增加，直到其数量达到胚细胞总数的2％～5％，在发育成熟的子叶中，约0.1％的细胞含芥子酶，在叶片中，芥子细胞的数量仅占总细胞数的0.05％，在拟南芥的种子中，没有芥子细胞，拟南芥的芥子细胞仅存在于韧皮部薄壁细胞中，在油菜的叶片及韧皮部内部。都有芥子细胞，茎和花�的木质部也有报道说与芥子酶抗体相互作用，但An-dreasson等用更高的抗体稀释度重复研究的结果表明，在油菜的茎和花�中，芥子酶仍然位于韧皮部或者异化芥子细胞中，由于物种间芥子细胞的分布的差异，jorgensen等将芥子细胞的分布作为物种鉴别的指标之一，比如木瓜仅有气孔芥子细胞。
　　
　　4　植物以外其它生物的芥子酶
　　
　　芥子酶活性在植物以外的某些生物体中被检测到，这些生物包括昆虫、真菌和细菌，有些蚜虫能释放含异硫氰化物的信息素，Dawson等推测这种信息素是蚜虫用自己的芥子酶降解食物中的硫代葡糖苷产生的，最近。一种菜蚜(Brevicorynebrassicae)的芥子酶被几个研究组分离纯化，序列分析结果表明，此酶与植物芥子酶的同源性较低，显示动物和植物芥子酶的起源可能不同，可能是专性害虫和植物平行进化的产物，芥子酶在菜蚜中的分布与植物中类似，也是集中储藏在个别细胞中，推测菜蚜利用植物的硫代葡糖苷作为自身的防御武器，在受到天敌攻击后，储藏的芥子酶将硫代葡糖苷降解为警报信息素E-beta-farnesene，目前已克隆了菜蚜芥子酶的cDNA。
　　1958年，Resse等在筛选300种真菌和30种细菌后，发现约8％的微生物具有吸收硫代葡糖苷Sinigrin的能力，但是，不能排除这些微生物仅积累Sinigrin却不代谢的可能性，1969年，Oht-SUIM等从Aspergillus部分纯化芥子酶(当时叫Sinigrinase)，证实真菌中存在芥子酶，被记载有芥子酶活性的细菌有Paracolobactrumaerogenoidesr及肠道细菌Enterobacter cloacae，然而，目前还未见这些芥子酶DNA和蛋白质序列的报道，很难断定这些芥子酶在进化上是否与植物的芥子酶相关，这些微生物芥子酶活性也可能来自底物特异性较低的普通。O-β-葡糖苷酶，微生物芥子酶活性的生物功能可能与利用寄主植物的硫代葡糖苷有关，Borek等报道在土壤中检测到芥子酶，认为酶活性来自土壤微生物，可能与十字花科植物特殊根际环境有关。
　　
　　5　硫代葡糖苷／芥子酶系统起源进化
　　
　　硫代葡糖苷／芥子酶系统可能起源于生氰葡糖苷及相应的O-β-葡糖苷酶，该假设是基于硫代葡糖苷与生氰葡糖苷在结构和生物合成方面的相似性，以及芥子酶和生氰葡糖苷酶在一级、二级乃至四级结构上的相似性，生氰葡糖苷在植物界分布很广，包括蕨类、裸子植物、被子植物等，说明生氰作用是一个较早的进化事件，硫代葡糖苷却主要分布在白花菜目[orderBrassicales，or Capparales(旧名)]，因此，硫代葡糖苷／芥子酶系统产生较晚，到目前为止，被报道何时具有硫代葡糖苷和生氰葡糖苷的植物只有番木瓜(Carica papaya)，另有一个物种(Koebelinia Spinnosa)，有芥子细胞，却缺乏硫代葡糖苷底物，由此认为它可能失去了合成这些化合物的能力，通过系统进化的研究，还有人提出植物界硫代葡糖苷／芥子酶系统的形成是两次独立的演化事件。
　　十字花科植物由于种子数量多，一般能快速拓展地盘，但它们也受许多专性病虫的抑制。因此相信硫代葡糖苷／芥子酶系统在其中起重要作用，野生拟南芥由于在生长季节早期就完成生活周期，躲避了大规模虫害，而在夏季生长的较大型的十字花科植物如油菜和黑芥，就没那么幸运，由于新发现的TGG4和TPTGG5基因类型目前仅在拟南芥中发现，它们很可能是在拟南芥从其它十字花科植物中分化出来后出现的，传统的芥子酶在植物体内的分布，拟南芥和较大型的十字花科植物差异很大，拟南芥的两个有功能的芥子酶基因TGGl和TGG2都在地上部的韧皮部表达，油菜和黑芥中有20多个基因，它们既在韧皮部表达，也在植物各个部位的芥子细胞中表达，因此，芥子酶在较大型的十字花科植物中的演化可能分为两个步骤。首先芥子酶出现在韧皮部，然后出现在植物各个部位包括种子的芥子细胞中，第一个演化步骤发生在拟南芥与其他十字花科植物分化之前，第二个演化步骤发生在拟南芥与其他十字花科植物分化之后，这一观点得到芥子酶分子系统进化研究的支持，油菜和黑芥的芥子酶基因可以分为MA、MB、MC 3个亚家族，但拟南芥的芥子酶基因TGGl、TGG2无法分到其中的任何亚家族，MA、MB、MC 3个亚家族的形成发生在拟南芥与其他十字花科植物分化之后。
　　
　　6　硫代葡糖苷／芥子酶系统的可能功能
　　
　　1)营养储备功能：白花菜目植物的成功在于其能生产大量的硫含量高的种子，硫代葡糖苷含硫和氮，被认为是硫和氮的储藏库，油菜对硫有非常高的需求，它对硫的需求量是禾本科植物的3倍以上，油菜在缺硫的土壤中生长，硫代葡糖苷的合成严重受阻，如果种子积累硫代葡糖苷不足，油菜幼苗对土壤硫缺乏就更敏感，拟南芥种子中仅含硫代葡糖苷，芥子酶在种子萌发后才合成，显示硫代葡糖苷可能作为拟南芥种子的营养储备。
　　2)对兼性病虫的防御功能：兼性昆虫对硫代葡糖苷降解物的毒性非常敏感，Giamounstaris等用硫代含量不同的油菜品系进行田间抗虫试验，结果表明，随着硫代含量的升高，兼性昆虫的危害显著降低，硫代的降解物也被证明对根部病原菌和线虫有毒性。
　　3)与专性昆虫的互动：不少研究者认为硫代葡糖苷是有些专性昆虫的食物和刺激剂，硫代葡糖苷的气味可以帮助专性昆虫找到寄主植物，一种硫代葡糖苷sinigrin的降解物allyl isoth-iocyanate已被用来诱捕油菜专性害虫，不过，有研究表明，并不是硫代葡糖苷浓度越高，专性昆虫就越偏爱，硫代葡糖苷浓度中等的品种，专性昆虫的种群数量最大，说明即使是专性昆虫，硫代葡糖苷对它仍有一定抑制作用，含硫代植物产生的气味对害虫天敌也有吸引力，另一方面，害虫可以通过警报信息素逃避天敌。
　　4)对人类的影响：十字花科作物如B.nigra(黑芥)B.oleracea(花椰菜、花菜、白菜等)的特殊气味是硫代葡糖苷降解物，当菜油从菜籽中提取后，硫代葡糖苷残留在菜籽饼中，由于有刺激性的气味和味道，以及降解物的毒性，菜籽饼作为饲料受到限制，近年来，由于降解物抗癌作用的发现，硫代葡糖苷的负面形象有所改观，另外，硫代葡糖苷还可以作为化学合成的起始物，芸苔作物是非常好的轮作作物，能给下轮作物带来许多好处，包括硫代葡糖苷残留物有抗病和抗线虫的作用，芸苔植物组织作为除草剂的潜在用途也有报道。
　　
　　作者简介：庞道标(1964－)，男，海南琼海人，副研究员，从事植物保护学研究；吴宇佳(1982－)，女，吉林长春人，硕士研究生，与第一作者贡献相同，从事作物遗传育种研究；张家明(1966－)，男，湖北公安人，研究员，博士生导师，通讯作者，从事分子生物学及作物遗传育种研究。