ｕＰＡ基因重组ＧＦＰ－腺相关病毒载体质粒的构建及其表达:基因重组质粒提取

　　摘　要：利用基因重组技术，用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得μPA cDNA，再克隆到质粒pAAv-IRES-hrGFP的多克隆位点，构建重组质粒pAAV-hrGFP-uPA，通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性，采用磷酸钙共沉淀法，以重组质粒pAAv-hrCFP-uPA和pAAv-RC、pHelper共转染AAv-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒；用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中，倒置荧光显微镜观察GFP的表达，用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达，结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒，病毒滴度达每mL4×1013病毒颗粒，60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒，感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白，为今后建立AAV－uPA基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础。
　　关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染
　　中图分类号：Q786　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0242－06
　　
　　尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料
　　AAV Helper-Free System(#240071)、pAAV-IRES-hrGFP(#240075)、AAV-293细胞(#240073)和XL10-Gold感受态细菌(#200314)购自美国Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)购自美国invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)购自美国Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)购自美国Fermen-tas MBI公司，限制性核酸内切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)购自美国NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)购自中国长沙安比奥公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技术有限公司合成，测序由上海生工生物技术有限公司完成，兔抗Flag M2抗体(F1804-200UG)购自美国Sigma公司，2周龄SD雄性大鼠购自中南大学湘雅二医院动物实验中心，肾小管上皮细胞由中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室保存。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　大鼠肾脏uPA基因的获得
　　取Spragoc-Dawleg 2周龄雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取肾脏总mRNA，逆转录合成eD-NA第一链，PCR法特异扩增uPA cDNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，uPA cDNA为1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切产物，置pH8.0 TE缓冲液中，uPA cDNA-20℃保存。
　　1．2．2　pGEM-T-uPA重组质粒的构建
　　将uPA cDNA用T4 DNA ligase连接到pGEM-T Easy载体上，并转染到JM 109感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃恒温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mLLB培养液内(Amp)，于37℃摇床内培养14h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到pGEM-T-uPA重组质粒，将重组质粒用BamHI/Xho I双酶切后，证实含相应的uPA基因片断，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片断，-20℃保存。
　　1．2．3　pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的构建
　　将上一步骤中获得的uPA基因片段用T4DNA ligase连接到pAAV-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点，并转染到XL 10-Gold感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mL LB培养液内(Amp)，于37℃摇床内振摇培养14～16h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到DAAV-hrGFP-uPA重组质粒，将重组质粒用BamH I/Xho I双酶切后，证实含uPA基因片断，DAAV-hrGFP-uPA重组质粒送检测序，准备足够的pAAV-hrGFP-uPA重组质粒和其他两个辅助质粒oAAV-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超纯质粒，供下一步转染实验。
　　1．2．4　AAV-293细胞培养
　　AAV-293细胞来源于普通的HEK293细胞系，但是可以产生较高的病毒滴度，HEK293是转染了腺病毒5型DNA的人胚胎肾细胞，AAV-293细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，AAV-293细胞贴壁不牢，轻吹大瓶壁即可传代，在细胞达到50％融合时传代，且传代不宜超过20代，同时注意传代和接种时不要让细胞 成块。
　　1．2．5　pAAV-hrGFP-uPA的产生及鉴定
　　接种3×106个AAV-293细胞于100mm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养2d细胞达到70％～80％融合时，吸取每个质粒溶液pAAV-hrGFP-uPA质粒、pAAV-RC和pHelper(浓度均为1g/L)各10μg加入到15mL柱状试管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，轻轻混匀，加入1mL 2×HBS于另一柱状试管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反复吹打混匀，以点滴方式加入DNA/CaCl2/HBS悬液于AAV-293细胞的培养皿中，旋转均匀分散该DNA悬液，将培养皿放人37℃的培养箱中培养6h，培养结束后，添加10mL新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃培养箱中培养72h，培养结束后，收集培养基和细胞于15mL的柱状试管中，经过4次冰冻和解冻(37℃)循环，每次持续10min，然后于室温中离心(10000g)10min，转移上清(初病毒储存液)于另一新的试管中置-80℃保存，Buffer TE代替质粒作阴性对照，转染后48h倒置荧光显微镜观察GFP表达，以确定转染成功；转染后72h收集病毒颗粒，并将获得的病毒颗粒再次感染AAV-293细胞，以确定其感染能力。
　　1．2．6　病毒载体的纯化与滴度测定
　　对重组的pAAV-hrGFP-uPA用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析进行纯化：纯化后用斑点杂交方法检测重组病毒的滴度；利用高压液相层析(HPLC)法检测重组病毒的纯度，具体方法参照文献。
　　1．2．7　uPA基因转染肾小管细胞及其表达的测定
　　按每孔1.5×105个肾小管细胞接种于12孔培养平板中，培养细胞达到70％融合，每孔添加终浓度为4mol/L羟基脲和1mol/L丁酸纳，混匀后，放人培养箱中继续培养5～6h，吸出培养基，加入1.5mL预温的含20％小牛血清的DMEM/F12培养基和相应的病毒存储液0.5mL，继续培养48h，培养结束后。倒置荧光显微镜观察GFP表达，uPA基因的表达以Flag标记蛋白进行免疫组化染色来判断，一抗为兔抗Flag M2抗体(1:200)，二抗为生物素化的羊抗兔抗体，加SABC孵育后进行DAB显色。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　uPA cDNA片段的获得
　　用RT-PCR法扩增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，琼脂糖凝胶电泳证实所得到的基因片段是正确的(图1)。
　　　
　　2．2 pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的酶切鉴定
　　pAAV-hrGFP-uPA重组质粒经BamH I/Xho I双酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的构建正确(图2)。
　　　
　　2．3　pAAV，hrGFP-uPA重组质粒DNA序列分析
　　证实pAAV-hrGFP-uPA序列完全正确，无碱基突变。
　　
　　2．4　pAAV-hrGFP-uPA的产生
　　分别取 pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper质粒各10μg，经磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞2～3d，Buffer TE代替质粒转染细胞作阴性对照，阴性对照平皿中AAV-293细胞长满后有少量细胞漂浮，但平皿上一直布满细胞，培养基变成桔黄色，提示阴性对照没有病毒颗粒产生，转染质粒的AAV-293细胞逐渐聚集成团并漂离平皿，培养基中有大量漂浮细胞，培养基的颜色由桔黄色变为黄色，细胞肿胀、变圆，将质粒转染组在倒置荧光显微镜下观察，可见细胞呈绿色，表明转染成功(图3、4)。
　　
　　2．5　uPA基因转染肾小管上皮细胞及其表达
　　AAV-293细胞产生的病毒颗粒转染肾小管上皮细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察约60％～70％的肾小管上皮细胞表达绿色荧光蛋白，免疫组化法观察到肾小管上皮细胞可有效表达flag蛋白，细胞质中具有较多的棕黄色颗粒，阴性对照组均没有绿色荧光蛋白和flag蛋白的表达(图5、6)。
　　　　
　　3 讨论
　　
　　肾小球硬化和肾间质纤维化归根结底是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果，目前已知参与ECM降解的酶主要有3类：1)丝氨酸蛋白酶；2)基质金属蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前两类，uPA属于丝氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形态发生、组织修复和肿瘤浸润，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA还能切断纤溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-缬氨酸序列中的精氨酸-缬氨酸连接，催化无活性的纤溶酶原转变为纤溶酶，uPA对纤溶酶原的激活是一个正反馈逐级放大效应，纤溶酶是一广谱蛋白酶，能够降解存在于基底膜和，ECM的各种糖蛋白包括血纤维蛋白、粘连蛋白、层连蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，进而溶解血管内的纤维蛋白凝块和ECM成分，并形成细胞外局部溶解区。构成细胞转移的通道，有利于新生的内皮细胞迁移、生长进入周围基质，形成新的微血管；uPA又可激活MMPs，该酶是锌依赖性内肽酶，是参与基质降解的主要成分；还能激活肝细胞生长因子，肝细胞生长因子是一个有力的抗纤维化因子，对损伤肾脏有保护作用，基因治疗器官组织纤维化已成为慢性疾病治疗领域的研究热点，利用各种有效的和组织特异性的载体系统将降解ECM的外源基因导入细胞内，到达纤维化的组织和器官，可缓解纤维化程度，有研究报道腺病毒携带人uPA基因可诱导实验性肝硬化动物模型的肝硬化缓解，uPA促进HGF从基质中释放并活化，缓解肺纤维化，因此，利用基因转移技术增强uPA基因的表达可能会大大降解ECM成分，缓解肾脏纤维化。
　　由于肾脏细胞的有丝分裂指数较低，肾脏基因的转移效率至今仍不理想，因此，我们以新型的无辅腺相关病毒AAV-2作为载体，采用基因克隆技术，成功构建了携带uPA基因和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺相关病毒重组质粒，用来转移基因，本实验中所选用的pAAV-IRES-hrGFP质粒作为携带目的基因的主要载体，能同时表达目的基因蛋白、GFP和Flag蛋白，质粒中的GFP可作为病毒颗粒转染细胞成功与否及细胞定位的有效标记，Flag蛋白仅作为标签提示目的基因蛋白的表达，还可用来分析未知基因表达的情况，腺相关病毒(adeno-asso-ciated virus，AAV)属微小病毒科，能高效转染到各种宿主细胞中，AAV作为基因治疗载体的优势主要有：1)AAV是一种人源性的病毒，对人体无 致病性，免疫反应轻微，有利于体内转染；2)可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；3)AAV携带的外源基因可以长期持续稳定表达，并可调控；4)AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞：5)具有较好的热稳定性和抗酸碱性(pH 3.0～9.0)以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存，AAV基因组具有两个开放的阅读框架(ORF)，两端各有1个145bp的末端反向重复序列(ITR)，ORF编码非结构性蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、复制、包装中起重要作用，Cap蛋白是包装成完整病毒所需的衣壳蛋白，因此，重组AAV载体(rAAV)是用外源目的基因单位(包括启动子)替换AAV两端ITR系列之间的基因系列(Rep和Cap基因)而产生，传统制备rAAV载体包装系统主要包括：重组载体、辅助质粒(如Ad8)、辅助病毒(如Ad5)和宿主细胞，该方法的缺点是可导致腺病毒蛋白的污染，容易导致机体对载体的免疫反应，各项研究通过改造AAV载体基因结构、包装细胞以及改进病毒颗粒的纯化方法，可达到更高的病毒产率，rAAV载体经过不断改进和完善，已经克服了容量小和解决无腺病毒辅助的大量包装和复制问题：近年来又由于包装细胞系的诞生，加上其固有的优点，因而成为治疗遗传性疾病和慢性疾病最有前途的基因载体。
　　本实验在培养的肾小管上皮细胞中直接观察到GFP的表达，提示病毒颗粒成功转染细胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在肾小管细胞中表达，大约有60％～70％的肾小管细胞可感染此病毒颗粒，并整合到肾小管细胞中稳定、高效表达，Flag蛋白的表达反应了uPA蛋白表达的情况，GFP可在450-490nm的蓝光激发下发出绿光，GFP的多肽中含有丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸的环化结构，使GFP具有强烈的荧光性，GFP作为一种基因表达的标记物优于传统的报告基因，如LacZ、CAT、luc等编码酶蛋白的基因，GFP优点在于：1)GFP基因序列短、分子质量小、融合后不影响目的基因的表达和靶蛋白生理功能，不干扰细胞的生长和功能，且对细胞无毒性作用，因而能在活细胞状态下检测基因表达；2)观察更为方便，GFP是一种能在活细胞内直接观测、无需底物和内对照的报告基因，将GFP基因转染至真核细胞中表达后，可以方便地通过观察活细胞中GFP融合蛋白的绿色荧光分布，分析未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位，因此GFP作为一种极具潜力的标记物为研究基因功能及表达调控提供了极大的便利。
　　本实验成功构建了高效转染多种宿主细胞的重组载体质粒，为今后建立AAV-μPA基因治疗的体内肾纤维化模型奠定了良好的基础，并且为无特殊标记细胞移植治疗提供了一种稳定、有效的标记方法，可以追踪该细胞在体内的分布或分化情况。
　　
　　致谢：本实验在湖南师范大学生命科学学院生物化学与发育生物学教育部重点实验室进行，非常感谢全体老师和同学给予的帮助。
　　
　　作者简介：毕凌云(1978－)，女，河南新乡人，博士研究生，主要从事小儿肾脏病研究；易著文(1946－)，男，湖南华容人，教授，博士生导师，通讯作者，主要从事小儿肾脏病研究。