[遗传性β地中海贫血病ＣＤ１７点突变的快速简便检测]遗传性地中海贫血

　　摘　要：利用聚合酶延伸技术及双链特异性嵌入染料的特性，建立了一种快速简便的基因点突变的检测方法，在特定引物聚合过程中，不同基因型的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光信号的变化实现基因点突变的快速检测，不需要复杂的凝胶电泳、荧光和同位素标记等操作，通过对β珠蛋白基因CD17点突变的检测，证实该方法是一种廉价、简便、快速的筛查遗传性地中海贫血病β珠蛋白基因CD17点突变的方法，该方法可扩展到各种基因的点突变检测。
　　关键词：点突变；聚合酶；遗传性地中海贫血病；基因突变筛查
　　中图分类号：Q319.31　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0295-06
　　
　　β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(α2β2)的卢珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成α与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病，若胎儿同时接受来自父母的两个β地贫基因，则为突变纯合子，绝大多数表现为重型β地贫疾病，目前尚无有效疗法，这些病人往往幼年夭折或靠输血维持生命，通过基因检测预防地贫患儿的出生是控制该遗传病的可行方法。
　　β-地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白基因的CDl7(A→T)点突变是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一，β地贫基因突变的传统检测方法是以凝胶电泳为基础的方法。操作繁琐复杂，费时长，目前常用的诊断方法是聚合酶链反应结合斑点杂交技术，该方法准确性高，但需要放射性同位素标记和繁琐的分子杂交技术：Pun等报道了一种变性高效液相色谱基因分型新技术，无需放射性同位素标记，但这种方法操作复杂，仪器昂贵，实验周期长；新发展起来的实时荧光PCR技术已用于遗传性血色病HFE基因点突变检测，操作简便，但探针的设计难度和检测仪器成本较高，限制其广泛应用，
　　利用双链结合染料嵌入双链DNA发出荧光的原理，我们建立了一种在常温下实时检测聚合酶活性的简便方法，本文在此基础上，基于聚合酶延伸技术和双链特异性嵌入染料特性，发展了一种快速简便的点突变实时检测方法，该方法通过染料的嵌入和荧光信号的变化实现点突变检测，不需昂贵仪器，也不需复杂的凝胶电泳操作和标记等过程，操作方便、简单，利用该方法，对β地贫疾病相关的CD17突变进行了检测，该方法为基因点突变及单核苷酸多态性的检测提供了一个快速简捷的有效方法，为药物筛选、疾病防治和单倍型计划提供一种新的手段和思路。
　　
　　1　实验
　　
　　1．1　试剂与仪器
　　试剂：引物及寡核苷酸由大连宝生物公司(Takara)合成，序列见表1.Klenow Fragment(exo-)聚合酶(KF-酶，Fermentas)，SYBR Green I(上海科技发展有限公司)，TakaRa Ex taq酶(Takara)，dNTP Mixture(Takara)，Tris(Sigma)，二硫苏糖DTT(Bebco)，其它试剂均为国产分析纯，实验所用水均为过滤除菌的高纯水，实验器皿均经过高温灭菌，仪器：美国Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计，美国Amersham恒温水浴，ABI公司Ce-neAmPTM PCR System 2700。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1 荧光测定
　　本研究选用双链特异性结合染料SYBRGreen I，荧光强度的测定用497 nm光激发，在520nm处检测，仪器的入射狭缝与发射狭缝都设为2.5nm，样品除特别指出均在37℃恒温10min荧光值稳定后测定，样品溶液终体积均为200μL。
　　
　　1．2．2　点突变检测
　　配制底液1(100nmol/L引物N3，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1mmol/LDTr.50 μmol/L dNTP Mixture，1×SYBR GreenI)，分别在底液1中加入终浓度为100nmol/L的N1、N2和终浓度为50nmol/L的N1/N2，配制成A、B、C 3种样液，配制底液2(100nmol/L引物N4，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/LMgCl2，1mmo|/L DTF，50μmol/L dNTP Mixture(相同比例)，1×SYBR GreenI)，分别在底液2中加入终浓度为100nmol/L N1、100nmol/L的N2和终浓度为50nmol/L的N1/N2，配制成D，E，F3种样液。荧光强度稳定后分别加入2.5U KF-酶，连续监测荧光强度的变化。
　　1．2．3　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　利用传统电泳方法验证点突变检测结果。样液A、B、C分别在95℃变性5min，然后在O℃骤冷5s，用含7％尿素的20％聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染分析。
　　1．2．4　温度对检测的影响
　　分别在25、30、34、37、42、47℃向样液A中加入2.5U KF-酶，监测荧光强度变化，以聚合反应1000s时的荧光信号值与未加聚合酶的荧光本底的比值(S/B)为考察标准，考察温度对检测体系的影响。
　　1．2．5　金属离子对检测的影响
　　考察M2+、Ca2+、K+、Na+4种金属离子对聚合酶聚合的影响，调整样液A中MgCl2的浓度，考察Mg2+的影响；在样液A中分别加入CaCl2、KCI、NaCl溶液调整到不同浓度，参考文献[11]计算反应初速度，考察离子对聚合反应的影响。
　　1．2．6　地中海贫血遗传病点突变样品的制备以及检测
　　我们对地中海贫血遗传病的一种CDl7(A→T)点突变进行检测，10份样本(3份突变纯合子和3份杂合子来自南方医科大学医学遗传室，4份正常人样本来自本实验室)，样品的基因组总DNA按标准DNA提取技术从病人和正常人的外周血的白细胞中提取，引物(表1)按Primer 5.0设计，PCR体系(50νL)含有：0.5U的TakaRa Extaq酶，0.2mmol/L dNTP Mixture，1×PCR缓冲液，800nmol/L N6，10nmol/L N7及50ng总DNA，PCR反应程序如下：94℃变性5min，然后按94T变性30s，57℃退火35s，72℃延伸30s，循环40次，标准凝胶电泳法纯化PCR产物并检测OD值，在底液3(100nmol/L引物N5，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1mmol/LDTT，50μmol/L dNTP Mixture，1×的SYBR Green I)中进行检测。
　　
　　2　结果与讨论
　　
　　2．1　实验原理
　　实验原理见图1，设计特定等位基因引物，其3′末端终止于模板的突变(多态性)碱基位点，当模板与引物完全匹配时，引物在聚合酶的作用下延伸形成双链，双链特异性染料插入新生的双链区域，荧光强度增强，而当模板与引物3′末端不匹配时，引物不能有效进行延伸反应，没有荧光信号的变化。通过观察荧光信号的变化。实现点突变检测。
　　
　　2．2　点突变检测方法
　　根据文献[13～15]，我们用人工合成的寡核苷酸模拟地中海贫血遗传病CD17点突变靶序列(表1)，N1和N2分别代表点突变的两种纯合子基因型。50％的N1/N2的混合样品模拟杂合子基因型，图2是利用特定等位基因引物进行点突变检测的结果，引物N3的3′末端终止于突变碱基位点，并与N1纯合子完全匹配，在聚合酶作用下，互补的dNTP逐个被加到引物3′-OH末端形成双链结构，染料SYBR Green I嵌入双链产生荧光，随时间延长，荧光信号逐渐增强(曲线1)；当模板是N2纯合子时，引物N3的3′端与其不匹配，不能有效发生聚合延伸反应，没有明显的荧光信号增加(曲线3)；当模板是杂合子型时，荧光信号也有显著的上升(曲线2)，但是其荧光增长速度明显小于曲线1，通过荧光的变化，3种基因型得以有效区分，为了更好的进行点突变检测，我们还利用与N2纯合子完全匹配的引物N4来进行检测，当模板是N1时，加入聚合酶，由于引物N4的3，端与其不匹配，荧光信号没有明显变化；当模板是N2时，随着DNA聚合酶的加入，荧光信号迅速增强，当模板是杂合子型时，荧光也有增强，但是增长程度小于完全匹配的模板N2，这个检测结果与使用N3引物检测时相同(图未显示)。
　　
　　2．3　聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　我们用传统的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对点突变检测结果进行验证，图3中泳道1～3分别为N1、N2和N3的条带；泳道4～6分别是样液A～C的反应样液，我们发现，泳道4中(样液A)，由于引物N3以N1为模板进行聚合反应，引物N1带消失，而在模板N1带的上方出现了一条聚合产物带(为了区分聚合反应生成的产物和原有的模板，设计的引物5′端相对模板N1多出2个碱基“AG”，因此条带4的模板上方的新带为聚合产物)；泳道5(样液B)由于不能发生有效的聚合反应，模板N2与引物N3带继续存在：泳道6是样液C的反应液，可见引物带、模板与聚合产物带，但是聚合产物带与泳道4相比，亮度减弱，说明聚合反应产物较泳道4少，以上电泳结果与荧光实验结果一致，说明此荧光分析方法是一种可靠、准确的基因分型方法。
　　
　　2．4　温度对检测的影响
　　调整恒温水浴使温度分别控制在25、30、34、37、42、47℃，向样液A中加入聚合酶，监测荧光强度的变化，结果如图4所示，由图4可知，随着温度的升高，荧光信号与未加聚合酶的荧光本底的比值(S/B)升高，但是当温度超过37℃时，S/B值下降，因此点突变检测时选择37℃作为检测温度。
　　
　　2．5　金属离子对检测的影响
　　点突变检测是基于聚合酶延伸反应进行的。聚合酶的聚合效率对该方法信号的产生及灵敏度有重要影响，我们分别考察了几种重要金属离子(Mg2+，Ca2+、K+、Na+)对聚合反应的影响(图5)，从图中可以看出：当M广不存在时，不能发生聚合反应，随着Mg2~浓度的增加，反应初速度增加，当Mg2+浓度达到10～15mmol/L时，反应初速度最大，当其浓度继续增加时，对聚合酶的活性有一定抑制作用，这说明了Mg2+作为聚合酶的激活剂在反应中是必不可少的；而低浓度的Ca2+(小于20mmol/L)对聚合酶的活性影响不大，当Ca2+浓度大于30 mmol/L。对反应速度有明显的抑制作用；K+和Na+的存在均对聚合酶活性有抑制，且随着浓度的增加，对聚合酶活性的抑制越大，当K，和Na+浓度高于100mmol/L时，聚合反应基本上被抑制。
　　
　　2．6　地中海贫血病点突变的基因分型
　　地中海贫血是遗传性血液病，我们对其一种CDl7点突变类型进行了检测，结果见图6，从图中可以看出，在未加聚合酶时，3种基因型样品的荧光信号相似，但是加入聚合酶后，3种基因型之间显示出明显的差异，与引物(N5)完全匹配的突变纯合子加入聚合酶后，荧光信号剧烈上升(曲线1)；野生型纯合子加入聚合酶后，荧光信号没有明显变化(曲线3)；而杂合子加入聚合酶后，荧光信号也有较大增长。但荧光比突变纯合子明显低(曲线2)，通过染料分子的加入和荧光信号的观察，方便、快速、准确的将CDl7(A→T)点突变区别鉴定。
　　
　　3　结论
　　
　　基于聚合酶延伸技术，通过双链特异性荧光染料嵌入，直接以荧光信号的变化给出点突变基因分型结果，该方法不需要对引物和寡核酸进行放射性同位素标记或荧光标记。成本低；实验操作简单，不需凝胶电泳检测及复杂昂贵仪器，为预防、筛查点突变导致的遗传性疾病提供一种简便快捷的方法，也为单核苷酸多态性的基因分型的单倍型计划提供了新的思路。
　　
　　作者简介：孟祥贤(1972―)，女，湖南华容人，湖南大学副教授，博士，从事分子水平上的生物分析化学研究；王柯敏(1957―)，男，湖南沅江人，湖南大学教授，博士，通讯作者，从事纳米及分子水平上的生物分析化学及纳米生物技术研究。