[曲古抑菌素Ａ对结肠癌细胞株ＳＷ４８０细胞周期影响的机制研究] 细胞周期偏高是癌症吗

　　摘 要：为了研究组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对结肠癌细胞周期和凋亡的影响，初步探讨TSA作用细胞周期的可能机制，将人结肠癌细胞系SW480经TSA处理后，运用流式细胞术检测细胞周期、凋亡以及细胞周期素的变化，最后采用western-blot对细胞周期相关的基因进行检测。结果表明，TSA处理细胞后，TSA能够延缓细胞周期G1-S进程，阻滞细胞于G1期，并且影响细胞周期素cycliE、cyclinA聚集，而对凋亡无明显的影响。Westem-blot显示，TSA能够上调p21Wafl/Cipl、p27Kipl的表达，下调CDK2、cyclinE以及cycli-nA的表达。以上结果说明在结肠癌细胞中，TSA能够通过上调p21Waftl/Cipl、p27Kipl的表达以及下调CDK2、cy-clinE、cyclinA的表达，从而阻滞细胞周期于G1期，最终影响肿瘤细胞的生长，以上研究为HDAC抑制剂应用于结肠癌治疗提供了理论依据。
　　关键词：结肠癌；曲古抑菌素A(TSA)；细胞周期
　　中图分类号：Q786；R735．3+5
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007―7847(2006)01-0039-06
　　真核细胞中，遗传信息贮藏在高度保守的染 色质中，染色质的基本结构单位是核小体，核小体 是由146 bp的DNA包绕着核心组蛋白构成的， 核心组蛋白包括：H2A、H2B、H3、H4.核心组蛋白 在进化中是高度保守的，而可被翻译后修饰的主 要是核小体外的N端的氨基酸尾巴。组蛋白末 端能被各种不同的翻译后修饰，包括：乙酰化、甲 基化、磷酸化。其中乙酰化、泛素化修饰赖氨酸； 磷酸化修饰苏氨酸、丝氨酸；甲基化既能修饰精氨 酸又能修饰赖氨酸。
　　现在研究得比较清楚的翻译后修饰是乙酰化 修饰对细胞生物学的影响，通常情况下，HDAC (组蛋白去乙酰化酶)和HATs(组蛋白乙酰化酶) 调节着赖氨酸和精氨酸的乙酰化状态，以保持基 因的活性或失活状况，组蛋白乙酰化与基因活化 以及DNA复制相关，组蛋白的去乙酰化和基因的 失活相关。乙酰化转移酶(HATs)主要是在组蛋 白H3、H4的N端尾上的赖氨酸加上乙酰基，去乙 酰化酶(HDACs)则相反，不同位置的修饰均需要 特定的酶来完成。乙酰化酶家族可作为辅激活 因子调控转录，调节细胞周期，参与DNA损伤修 复，还可作为DNA结合蛋白。去乙酰化酶家 族则和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周 期、细胞分化和增殖以及细胞凋亡相关。
　　结肠癌是多基因、多步骤的致癌过程，包括癌 基因的激活和(或)抑癌基因的失活等。而在基因 的表达调控中，表观遗传修饰有着重要的作用， 主要包括DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰。 曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)是去乙酰化酶 (HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂可以通过抑制组 蛋白去乙酰基酶(HDACs)，阻断由于HDAC募 集功能紊乱而导致的基因表达受抑，从而达到 抗肿瘤效应，本研究通过TSA体外作用于结肠 癌细胞SW480，对处理作用前后细胞的细胞周 期、细胞周期素以及相关的蛋白表达进行观察 与研究，从而探讨TSA的作用机制，为将更为有 效的HDAC抑制剂应用于结肠癌治疗提供理论 依据。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 主要试剂
　　TSA溶于DMSO(二甲基亚砜)中，浓度为(1 g／L)置于-20℃冰箱。TSA及DMSO均购自Sigma 公司(由晶美生物工程有限公司代理)，RPMll640 购自GIBCO公司，小牛血清购自杭州四季清公 司，MIT购自宝泰克公司。一抗p53、p21、p27、 CDK2、cyclinE、cyclinA、a-tublin购自SantaCruz， anti-AcetylatedH3购自Upstate。
　　
　　1.2 细胞株及细胞培养
　　SW480细胞系购自中南大学分析测试中心 细胞生物室。采用10％小牛血清的RPMll640 培养液(含有1 x105U／L)青霉素和100mg／L 链霉素)，在37t、5％的C02孵箱中培养．取对 数生长期细胞进行实验。
　　
　　1．3 细胞周期分析
　　收集TSA作用8h后的细胞，用70％的预冷 乙醇固定24h 以上，加1 mLPC缓冲液和100 mg／LRNase(Sigma公司)50μL后，再加人50 mg／L碘化丙锭(Sigma公司)5001tL，4℃室温避 光30min，而后用流式细胞仪(FACSsort，Becton Dickinson)分析细胞周期。
　　
　　1.4 WesternBlot
　　用3去污试剂提取总蛋白质，用Bradford方 法测定蛋白质浓度。等量蛋白质采用SDS聚丙 烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离，然后转至PVDF 膜上，室温下摇动封闭(TBS2T+5％脱脂奶粉) 2h后，加入相应的一抗4℃过夜，室温下洗膜后 加入辣根过氧化物酶(HRPO)偶联羊抗鼠IgG，最 后用化学发光底物进行发光显迹，
　　
　　1.5 细胞乙酰化水平的检测
　　对于TSA处理细胞后乙酰化水平的检测，我 们主要采用western-blot的方法，针对乙酰化组蛋 白3的表达水平来判定处理后细胞的乙酰化水 平，并且采用a-tublin做为内对照。
　　
　　2 结果
　　
　　2．I TSA能够提高SW480细胞乙酰化水平
　　我们根据文献提供的TSA浓度(50μg／L)r5l， 处理细胞，分别在0、2、4、8、16h收集细胞，采用 acetylatedH3抗体进行western-blot检测其处理后 细胞的乙酰化水平，a-tublin做为内对照，结果(图 1)显示：95A处理后2h乙酰化水平开始增加，8h 到达高峰，16h后乙酰化水平略有下降。这说明 TSA处理SW480细胞8h后乙酰化水平到达最高 峰，故在下面的实验中我们都以TSA(501xg／L)处 理细胞8 h为基础进行研究。
　　
　　2．2 TSA能够阻滞细胞周期G1－S期进程，并且 能够明显下调细胞周期紊cyclinE、cyclinA的表达
　　我们将TSA处理细胞8h后，用乙醇固定，然 后进行流式细胞计数分析，结果(图2)显示：TSA 处理后，Go／G1细胞从36．29％升高到60，21％，说 明TSA能够阻滞细胞周期G～S期进程．而对凋 亡无明显影响。进而我们对细胞周期素cyclinDl、 cyclinE、cyclinA以及cyclinB进行了检测，结果显 示：TSA处理细胞后，细胞周期素cyclinDl以及 cyclinB处理前后无明显的改变(结果未显示)，而 cyclinE与cyclinA经TSA处理后明显降低(图3)， 这说明TSA能够降低cyclinE与cvclinA表达。
　　
　　2．3 TSA处理细胞后能够上调p21wan/cipl p27kip1、下调CDK2以及进一步证实下调cyclinE 以及cyclinA表达。
　　由于通过流式细胞分析我们发现TSA处理 细胞后能够阻滞细胞于C1期，并且发现cyclinE 和cyclinA下调，而cyclinE，cyclinA主要在细胞周 期C1的中晚期表达，这说明TSA可能主要作用于 C1的中晚期，因而我们进一步采用了western-blot 对p21、p27、p53、CDK2等影响细胞周期C1中晚 期的关键分子进行了检测，结果显示(图4)：TSA 处理细胞后，对p53表达无明显影响；但能够明显 上调p21wan/cipl和p27kipl，的表达以及降低Cdk2、 cvclinE以及cyclinA的表达。
　　
　　3 讨论
　　
　　组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase HDACs)，其功能是催化乙酰化的核心组蛋白脱去 乙酰基，这种脱乙酰酶可能介导了某些位点特异 DNA结合的转录抑制子抑制转录的功能，或者通 过脱乙酰化改变了染色质的构象而抑制转录，故 脱乙酰化与转录抑制有关。组蛋白乙酰化酶和脱 乙酰化酶本身可能参与了转录调控，而乙酰化与 脱乙酰化的结果也影响基因的活性，而且是激活 与抑制两种相反的作用。通过组蛋白乙酰化水平 的动态变化来发挥正反两方面的作用，使转录在 对立统一的基础上受到调节，以满足生命活动的 需要。
　　许多研究报道HDAC抑制剂如NaBu和TSA 能够诱导多种肿瘤细胞的生长停滞或凋亡。 本研究中我们采用TSA(50μg／L)处理结肠癌细 胞SW480后，流式细胞计数分析发现Co／G1,期细 胞明显增多，细胞周期C1-S进程被延缓，细胞阻 滞在C1期，而对凋亡无明显影响，通过对细胞周 期素的分析，我们发现TSA处理后cyclinDl、cy- clinB无明显的改变，cyclinE以及cyclinA被明显 下调。
　　真核细胞的细胞周期行进受细胞周期依赖性 蛋白激酶(Cyclindependentkinases，CDKs)、cdk 亚单位和周期素调节亚单位调控。目前，人类细 胞主要的CDKs有CDKl(CDC2)、CDK2、CDK4、 CDK5、CDK6、CDK7(CDK activating kinases， CAK)；主要的周期素有CyclinA、CyclinB、Cy－ clinDl、CvclinD2、CyclinD3和CyctinE．CDK的时 相性激活是细胞周期调控机制的核心，它主要依 赖于Cvclin蛋白表达的细胞周期特异性起伏来调 节，二者的协调性表达确保了细胞周期发生的时 间性、协同性，在细胞周期行进的不同时期，由不 同Cvclin蛋白的表达驱动，如：CDC2与Cyclin B1的结合是M期事件的启动和进行的必要条 件，CDK2与Cyclin A的结合是C2期事件的启动 和进行的必要条件，CDK2还负责S期的进行，与 Cyclin E结合是S期启动的必要条件，CDK2、 CDK4与Cyclin结合，而CDK2、CDK4、CDK5、 CDK6与CyclinDl、D2、D3结合是Cl期运行的必 要条件。
　　CylinE主要表达于C，中晚期，是哺乳动物细 胞周期通过C，期进入S期所必须的限速因素之 一，它通过与Cdk2相互作用，调节细胞周期的 行进，Cdk2结合CyclinE形成的CyclinE／Cdk2复 合体，通过直接结合E2F／P107，使其释放E2F的 CvclinA启动子结合位点，激活CyclinA转录，加 速细胞周期跨过C1／S关键点，进入S期，Cyctin A作为S期的主要调节蛋白，在Cl晚期开始表达 合成，是S期DNA复制所必需的。当肿瘤抑制基 因如p27KipI的表达减少，CyclinE／Cdk2与E2F／ P107即可在C1晚期形成复合体，促进CyclinA的 合成，加速细胞周期行进，因此，细胞进AS期 和G2／M过渡离不开CyclinA的功能。
　　我们发现TSA处理细胞后能够下调CyclinE 和Cdk2表达，这说明TSA能够抑制C2期的Cy－ clinA激活和合成，将细胞周期行进阻滞于C1晚 期．对于p21wafl/cipl和p27kipl，研究表明 可以通过抑制CyclinE和Cdk2的相互作用将细 胞周期阻滞于G1期。同样，p27kipl可以通过诱 导E2F抑制复合体的形成，并抑制E2F调节基因 的表达，阻断CyclinE依赖的CyclinA的表达造成 细胞周期的G1期捕获。通过westerBblot我 们进一步分析了CDK抑制子p21wai/ciPl和p27kipl 表达的活性改变，结果显示：TSA处理细胞后 p21wal/cipl和p27Kivl表达上调，结合对Cdk2的分 析结果，认为TSA可能通过上调p21wafl/cipl和 p27kipl的表达、抑制Cdk2的激酶活性，达到阻止 细胞周期进行，影响细胞增殖的目的。
　　本研究通过TSA体外作用于结肠癌细胞 SW480，初步阐明了TSA阻滞结肠癌细胞SW480 细胞周期于C1期的可能机制，这为HDAC抑制剂 应用于结肠病治疗提供理论依据。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文