[人角膜细胞在体外培养的研究进展①] 兔角膜内皮细胞的原代培养

　　摘 要:人角膜是光通过的窗口,在维持眼压和对光路调节方面也起着重要的作用,由角膜缺损或病变引起的眼疾严重时会导致患者失明。目前治疗这类疾病的唯一办法就是角膜移植,但是及其匮乏的角膜供体使得多数患者失去重新获得光明的机会。近些年来兴起的组织工程人角膜体外重建技术给数以千万计的患者带来了福音。来自自体的人角膜细胞是上述组织工程所需的最理想的种子细胞,本文就人角膜细胞在体外的培养和扩增的进展和存在的问题进行综述。
　　关键词:人角膜上皮细胞 基质细胞 内皮细胞 体外培养
　　中图分类号:R772 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2012)05(c)-0231-01
　　组织工程人角膜体外重建基本方法是取一定量种子细胞,将其成功迁入到生物相容性良好的载体中,形成结构与人角膜相似的组织工程眼角膜。来源于病人本身的自体细胞是最理想的种子细胞,其最大的优越性在于植入人体后不会引起个体的免疫排斥反应。如果能将自体细胞在体外持续扩增培养,将会对组织工程人角膜体外重建做出巨大贡献。本文拟对人角膜三种细胞在体外扩增培养的研究进展、目前存在的问题以及解决途径进行综述。
　　1 人角膜细胞概述
　　人角膜细胞有三种:人角膜上皮细胞,人角膜基质细胞以及人角膜内皮细胞。形态结构各异的人角膜细胞在各自的区域行使着各自的生物学功能,共同维持角膜的透明度,厚度以及正常的生理功能。
　　人角膜上皮细胞根据其形状不同分为鳞状细胞,翼状细胞以及柱状细胞。其中鳞状细胞位于表层,靠紧密连接和黏着带形成一半渗透性膜。中间为翼状细胞,细胞与细胞间靠桥粒结构连接。底层为单层的柱状细胞,三种细胞中只有柱状细胞尚有分裂能力,且它还可以分泌产生基底膜,柱状细胞靠半桥粒结构固定于基底膜上。
　　人角膜基质细胞分布于角膜基质纤维板层之间,其形态非常扁平,从中央细胞体向各方延伸出许多长的分支,逐渐变细。这些分支的末端与邻近的细胞相接触,形成层间连接。它具有典型的蛋白质分泌细胞的细胞器,如核糖体,内质网及高尔基体等。正常情况下人角膜基质细胞处于静止、半脱水的状态,但在人角膜发育和修复时,人角膜基质细胞分泌和合成胶原纤维的能力增强。
　　人角膜内皮细胞排列成单层,构成人角膜内皮层。角膜内皮细胞呈规则的六角形,表面有很多微绒毛,细胞与细胞间的连接为桥粒和缝隙连接。细胞膜透明,透射电镜下可见胞浆中分布内质网,高尔基体以及较多的线粒体。人角膜内皮细胞没有增殖能力,随着年龄的增加,疾病或者眼内手术的影响,人角膜内皮的数量会慢慢减少,细胞的形状以及大小都会发生变化。
　　2 人角膜细胞培养概况
　　中山大学王智崇等人尝试建立利用连续传代培养的方法建立人角膜上皮细胞系[1]。该实验将无菌的眼球转入超净工作台后,用虹膜恢复器钝性分离角膜缘板层组织。随后剪成1mm3大小组织块,将组织块上皮面朝下贴在培养瓶中,干贴30min后补加少量完全培养液,静置培养。这些学者成功建立了2株角膜上皮细胞系。光镜下该细胞系细胞成典型的角膜上皮细胞形态,经免疫荧光检测发现该细胞系细胞表达角膜上皮细胞的特异的蛋白CK3。
　　谢立信等人尝试过人角膜基质细胞的原代培养[2],在无菌条件下获得人角膜基质片,将其切成4块,放进24孔培养板中。添加少量培养液,持续培养直到观察到组织块周围有角膜基质细胞贴壁生长之后再转移组织块至另一个孔内。原来的孔内补加培养液,使细胞分裂增殖形成原代纯基质细胞单层。光镜下观察角膜基质细胞密度越高,排列越整齐,呈典型梭形,染色后可见每个细胞有一个椭圆形的核。
　　以往角膜内皮细胞的培养方法是先剥离后弹力层及内皮细胞层组织[3],此种方法由于用力时力度不易掌握,而且反复刮除还容易使后弹力层破裂从而导致角膜基质细胞的污染,现在已不再采用。还有一种方法是酶消化法[4],将角膜内皮凹面朝上,加入消化酶并使消化酶仅作用于角膜内皮的部分从而收集原代内皮细胞,但在常因为由于操作的繁杂而难以达到预定结果并造成细胞本身的损害,同时角膜组织暴露时间过长而增加了污染的机会。目前采用的角膜内皮细胞原代培养方法大致上有三种,消化培养法,组织贴片培养法以及揭膜培养法。
　　3 人角膜细胞体外培养存在的问题以及解决途径
　　虽然来源于病人本身的自体细胞是最理想的种子细胞,有很大的优越性。但是自体来源的细胞具有局限性,来源有限、取材部位会受损伤、患病状态下或老年患者的细胞不宜用于移植。而将自体细胞在体外扩增到一定的数目,甚至建立成标准的细胞系,是致力于组织工程人角膜体外重建研究中学者们需要攻克的难关。
　　目前对种子细胞体外培养的研究应着重于以下几个方面,首先在不把癌基因或致使细胞永生化的一些其他基因片段导入细胞基因组的情况下,设计科学的培养方法使得人角膜细胞能在体外能连续传代培养,获得非转染的无致瘤性的细胞;同时致力于研究人角膜细胞在体外培养的情况下如何保持细胞的增殖能力,合成细胞外基质的能力以及能正常表达一些功能性蛋白行使正常的生物学功能等;除此之外还要致力于找出人角膜细胞在体外培养的情况下逐渐老化的本质原因,优化培养条件,提高培养技术,使在体外培养的人角膜细胞能大量增殖,最终建立形态学结构和生物学功能均正常的人角膜细胞系。
　　参考文献
　　[1] Diebold.Y,Calonge.M,Characterization of a Spontaneously Immortalized Cell Line (IOBA-NHC) from Normal Human Conjunctiva.Invest Ophthalmol Vis Sci,44:4263～4274.
　　[2] 谢立信,董晓光.人角膜细胞的原代培养实验研究[J].潍坊医学院学报,1990,12(1):10～13.
　　[3] tocker FW,Georging R.A tissue culture technique for growing corneal epithelial stromal,and endothelial tissues separately.Am J Ophthalmol,1958,46(5):294～298.
　　[4] Slick WC,Yuhasz Z.Enzymatic removal and pure culture of rabbit corneal endothelial cells.Arch Ophthalmol,1965,73:229～232.