论文范文 [2012科研设计-8-范例论文解读-2]

福建医科大学硕士研究生《 福建医科大学硕士研究生《医学科研设计》 医学科研设计》课程福建医科大学硕士研究生《 福建医科大学硕士研究生《医学科研设计》 医学科研设计》课程-Ⅱ一．科学研究基本过程与科学思维 二．科研课题基本环节及其筹划 三．实验设计基本方法 四．实验过程与实验记录 五．开题报告与文献综述 六．论文写作与学术报告 七．范例论文解读（1~3）江一平 教授/ 教授/博士 jiangyp1955@139.com福建医科大学生殖科学研究院Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe MInoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe MThe immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs(免疫球蛋白超家族成员Izumo是 精卵融合的必要蛋白) Nature 2005 Mar 10; 434(7030):234434(7030):234-8.The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs(免疫球蛋白超家族成员Izumo是 精卵融合的必要蛋白) Nature 2005 Mar 10; 434(7030):234434(7030):234-8.Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe MInoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe MThe immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs(免疫球蛋白超家族成员Izumo是 精卵融合的必要蛋白) Nature 2005 Mar 10; 434(7030):234434(7030):234-8.The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs(免疫球蛋白超家族成员Izumo是 精卵融合的必要蛋白) Nature 2005 Mar 10; 434(7030):234434(7030):234-8.

152Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe MThe immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs(免疫球蛋白超家族成员Izumo是 精卵融合的必要蛋白) Nature 2005 Mar 10; 434(7030):234434(7030):234-8.152152精卵融合揭密长期以来，精子中负 责与卵细胞膜融合的分子 的身份，一直向生物学家 们隐瞒着。 那 么 ， Izumo —— 这 个以日本婚姻母神的名字 命名的蛋白质，是否将给 精-卵带来美满姻缘？在有性繁殖生物的生命 历史中，受精是一个特异的 事件。在哺乳动物，精子和 卵子一旦在雌性生殖道出 现，其寿命就是有限的，但 受精挽救了他们。经过一个 多步骤的过程，他们的细胞 膜最终互相融合并形成了 “ 合子 ” 。尽管精卵相互作用 极端重要，尽管人们已经研 究了几十年，但精卵融合的 分子基础还是罕为人知。在 这个战场上，往昔的候选分 子们血流成河，饮恨而终。 终于，一个叫做 Izumo 的精子特异性蛋白闪亮登场 （由Okabe及其同事发表与 本期刊物第 234 页），以其 作为精卵融合之必要分子的 证据而令人侧目。152在有性繁殖生物的生命 历史中，受精是一个特异的 事件。在哺乳动物，精子和 卵子一旦在雌性生殖道出 现，其寿命就是有限的，但 受精挽救了他们。经过一个 多步骤的过程，他们的细胞 膜最终互相融合并形成了“合 子”。尽管精卵相互作用极端 重要，尽管人们已经研究了 几十年，但精卵融合的分子 基础还是罕为人知。在这个 战场上，以往的候选分子们 血流成河，饮恨而终。 终 于 ， 一 个 叫 做 Izumo 的精子特异性蛋白闪亮登场 （由 Okabe 及其同事发表与 本期刊物第 234 页），以其 作为精卵融合之必要分子的 证据而令人刮目相看。免疫球蛋白超家族成员Izumo是精卵融合的必要蛋白陈凌 译，江一平 校 (2005)作为构建人体的60万亿细胞的代表，精子和卵子相遇、互相识别并融合 形成新一代生命。精卵膜融合即受精是非常重要的事件，人们长期致力于寻 找与该事件相关的因子[1]。最近，已发现CD9是卵膜上与精卵融合相关的基[2-4]，但精子方面与卵膜融合相关的因子尚未找到。本文报道，运用抑 本因子[2-制融合的单克隆抗体[5]和基因克隆技术，我们找到了精子的融合相关抗原， Okabe 及 其 同事在本 文 中 所 描 述 的 结果重新 点 燃 了 人 们 对 这个研究 领域的希望之火。 并发现该抗原是免疫球蛋白超家族的一个新蛋白。我们将该基因命名为 Izumo并培育了该基因缺陷的小鼠品系。Izumo-/-小鼠是健康的，但其雄性不 育。雄性的 Izumo-/- 小鼠能产生外观正常且能结合并穿透透明带的精子，但 这些精子却不能与卵膜融合。人精子也含有Izumo，而且抗人Izumo抗体能阻 止人精子与去透明带的金黄地鼠卵融合。

受精生物学知识背景质膜 顶体外膜 顶体基质 顶体内膜 细胞核 赤道段 顶体后区顶体人精子结构模式图江一平 1996获能 顶体反应人精子顶体反应模式图人精子顶体反应的超微结构变化顶体反应后卵丘细胞放射冠 皮质颗粒 卵母细胞 纺锤体 极体透明带卵冠丘复合体受精过程模式图

0.1％透明质酸酶金黄地鼠卵子金黄地鼠卵子人精子精子尾0.05％胰酶雄原核金黄地鼠卵母细胞 异种体外受精小鼠受精卵何才姑 1999金黄地鼠卵的异种体外受精免疫球蛋白超家族成员Izumo是精卵融合的必要蛋白PS陈凌 译，江一平 校 (2005)PN BS作为构建人体的60万亿细胞的代表，精子和卵子相遇、互相识别并融合江澍 2001形成新一代生命。精卵膜融合即受精是非常重要的事件，人们长期致力于寻 找与该事件相关的因子[1]。最近，已发现CD9是卵膜上与精卵融合相关的基[2-4]，但精子方面与卵膜融合相关的因子尚未找到。本文报道，运用抑 本因子[2-PN PS制融合的单克隆抗体[5]和基因克隆技术，我们找到了精子的融合相关抗原，江一平 1989并发现该抗原是免疫球蛋白超家族的一个新蛋白。我们将该基因命名为 Izumo并培育了该基因缺陷的小鼠品系。Izumo-/-小鼠是健康的，但其雄性不 育。雄性的 Izumo-/- 小鼠能产生外观正常且能结合并穿透透明带的精子，但 这些精子却不能与卵膜融合。人精子也含有Izumo，而且抗人Izumo抗体能阻 止人精子与去透明带的金黄地鼠卵融合。江澍 2001人精子与金黄地鼠卵的 异种体外受精为了寻找人精子中与卵膜融合的关键因子，我们利用2-D 电泳分离小鼠精子粗提蛋白，然后用能特异性阻断精卵融合 的抗精子单克隆抗体OBF13[5]进行免疫标识，分离到一种精 子跨膜蛋白成分。我们以日语中的婚姻之神 “Izumo” Izumo”为之命 名。通过液相串联质谱（LCLC-MS/MS）分析发现，该蛋白中 的10条短肽段与小鼠蛋白质数据库中一段名为RIKEN的注册 序列的部分肽段完全匹配（NCBI 登录号：XM_133424 ）。 利用该序列设计引物，我们成功地利用RTRT-PCR从小鼠睾丸 总RNA中分离到该蛋白的编码序列。同时，从人类基因组数 据库中我们还查到了该蛋白的人类同源物的编码序列（NCBI 登录号： BC034769 ），该序列编码一种特殊的免疫球蛋白 超家族（IgSF），是一种I型跨膜蛋白，其胞外部分为免疫球 蛋白结构域，并可能含有一个糖基化位点（图1，a，b）。a. Izumo的氨基酸序列b. Izumo的结构域图1. Izumo基因的鉴定

C. Izumo蛋白在睾丸组织中特异性表达，图为小鼠各种组织中Izumo的免疫利用重组Izumo 蛋白制备的多克隆抗体进行免疫标识， 我们发现，小鼠Izumo蛋白大小为56.4KD，并只在小鼠睾丸 组织中表达（图1，c），而人类Izumo蛋白大小则为37.2KD （图1，d）。在完整精子的质膜上并不能检测到Izumo，这 与精卵融合过程发生于顶体反应之后而不是在射精之后的事 实是相吻合的。无论是人类还是小鼠，在顶体反应之后，都 能在精子表面检测到Izumo蛋白（图1，e，f），这可能是因 为 Izumo 不是定位在完整精子的质膜上，而是隐藏在质膜的 下方，顶体反应后才通过某种途径暴露于精子表面。这与小 鼠精子膜蛋白CD46的行为十分相似[6]。印记结构，从左到右依次为脑、心脏、胸腺、脾、肺、肝脏、肌肉、肾、卵巢、 睾丸以及精子， 可溶性蛋白的上样量为 30μg/Lane ，用 1μg/ml 的抗鼠 Izumo抗体检测。箭头所指为鼠Izumo蛋白。 d. 人类精子Izumo蛋白的免疫印记，箭头所指为人类Izumo蛋白。 脑 心 胸 脾 肺 肝 肌 肾 卵 睾 精 脏 腺 脏 肉 巢 丸 子56.4KD 37.2KDCd图1. Izumo基因的鉴定e. 用精子顶体特异性表达EGFP的转基因小鼠 进行Izumo的免疫染色，在顶体完整的精子 (顶体部位有绿色荧光，为绿色箭头所示)中 不能检测到Izumo蛋白，而只有在发生顶体 反应后，才能检测到 Izumo 蛋白（被抗鼠 Izumo多克隆抗体标记为红色，此时顶体被 破坏，绿色荧光消失）;f. 用抗人Izumo多克隆抗体 标记人类精子，发生顶 体反应者能被抗体标记 为红色（同时被 CD-64 抗体标记为绿色），但 是同样的抗体不能标记 顶体完整的精子（也不 能被CD-64着色）。为了分析Izumo在体内的生理功能，我们设计基因打靶 载体，利用同源重组技术将Izumo基因的2～10号外显子替换 为 Neo 基因（图 2 ， a ），然后通过 ES 细胞系（ D3 ）制备出 了 Izumo 基因缺陷小鼠模型，利用 SouthernSouthern-blot 筛选鉴定中 靶细胞以及生殖系传递小鼠（图2，b），在纯合突变小鼠个 体中未检测到 Izumo 的 mRNA 和 Izumo 蛋白的表达（图 2 ， c，d）。考虑到Izumo基因的剔除有可能造成相关基因表达 水平的升高或降低 [7] ，我们检测了 ADAM2[8] 、 CD147[9] 、 sp56[10]等一些目前认为与精卵互作有关的基因的表达水平， 结果表明在 Izumo 基因缺陷小鼠中，这些基因的表达水平与 野生型小鼠并无显著差异（图2，d）。图1. Izumo基因的鉴定a. 野生型小鼠Izumo基因结构、打靶载体以及突变体基因结构; Neo基因由磷酸甘 油酸激酶（PGK）启动子启动表达，白喉毒素A链由MC1启动表达（DT）； b. 基因剔除结果的Southern-blot分析，基因组DNA样品经EcoR I酶切，用3’端探 针杂交检测出1.5kb（野生型）和6.9kb（突变型）片段； c. 野生（+/+）、杂合（+/-）以及突变纯合（-/-）雄性小鼠睾丸总RNA（20μg） 的Northern-blot杂交分析，GAPDH为阳性对照。 d. Western-blot 结果显示突变纯合（ -/- ）小鼠精子没有表达 Izumo 蛋白，而野生 （ +/+ ）、杂合（ +/- ）型小鼠均有该蛋白的表达，突变纯合小鼠精子中的 ADAM2、CD147以及SP56均正常表达。F1代杂合子小鼠（Izumo+/ -）自交，产生43只野生型小 Izumo+/鼠（Izumo+/+ -）以及47只突 Izumo+/+）；92只杂合体小鼠（Izumo+/ Izumo+/变纯合体小鼠（IzumoIzumo-/-），符合孟德尔的基因分离规律。+/+/-+/× +/-+/+ 1/4 45Southern-blot Northern-blot Western-blot+/+/2/4 90 92-/+- /1/4 45 4743图2. 小鼠Izumo基因剔除

IzumoIzumo-/-小鼠身体健康， 没有明显的发育异常，雌性 IzumoIzumo-/- 小鼠表现出正常的 生育能力（图3，a），而雄 性 IzumoIzumo-/- 小鼠尽管能与雌 性 Izumo+/+ Izumo+/+ 小鼠发生正常的 交配、射精行为以及形成阴 栓，但却不能生育（图 3 ， a ）。在观察到 28 次阴栓的 情况下，9对IzumoIzumo-/-雄性小 鼠连续饲养 4 个月也没有观 察到妊娠；雄性 Izumo+/ -小 Izumo+/鼠仍然表现出正常的生育能 力（图3，a）。目前对基因剔除小鼠的 研究表明，至少有 4 个基因 的剔除会造成雄性小鼠的不 育，而这 4 个基因无一例外 的都是通过破坏精子与透明 带的结合能力从而造成雄性 不育的，而且这些不育小鼠 的精子活动能力受到影响， 不能迁移至输卵管部位 [7,8,11,12]。Izumo-/Izumo-/-、 、Izumo+/Izumo+/-雄性小鼠及 雄性小鼠及IzumoIzumo//-雌性小鼠的生育力分析（产仔数比 雌性小鼠的生育力分析（产仔数比 较），下方数字为亲本的数量（交配 较），下方数字为亲本的数量（交配 数量）； 数量）； Izumo-/Izumo-/-、 、Izumo+/Izumo+/-雄性小鼠及 雄性小鼠及IzumoIzumo//-雌性小鼠的生育力分析（产仔数比 雌性小鼠的生育力分析（产仔数比 较），下方数字为亲本的数量（交配 较），下方数字为亲本的数量（交配 数量）； 数量）；图3. Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育 Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育图3. Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育 Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育然而，我们的实验结果表明，Izumo基因的剔除并不妨 碍精子迁移至输卵管壶腹部（结果未显示。精子的活动率用 计算机软件分析，CASA：mean ±s.e.m. s.e.m.＝81.7±7.7% in Izumo+/ - sperm and 77±8.9% in IzumoIzumo+/Izumo-/- sperm，表明精 子活动率并不降低）。IzumoIzumo-/-小鼠的不育特性通过体外受 精实验证明（图3b、c和附件电影1），Izumo基因对小鼠的 受精过程的某一阶段发生影响，这一阶段毫无疑问是继精子 穿过透明带之后，因为我们的实验结果表明小鼠大部分的精 子都顺利通过了透明带，却大量聚集在卵子质膜外侧的卵周 隙之中（图3 d）。b/c. b/c. Izumo-/Izumo-/-及 及Izumo+/Izumo+/-精 精子 子的 的体 体外 外受 受精 精实 实验 验， ， Izumo-/Izumo-/-精子能够穿越透明带到达卵子质膜，但不 精子能够穿越透明带到达卵子质膜，但不 能与卵子融合，从而聚集在透明带卵周隙中，而 能与卵子融合，从而聚集在透明带卵周隙中，而 Izumo+/Izumo+/-精子则能与卵子发生融合 精子则能与卵子发生融合雄原核图3. Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育 Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育上图：许多 Izumo-/-精子聚集在卵子的卵周隙中 下图：用精子特异性的单克隆抗体 MN9对这些聚 集的精子进行标记，结果显示这些位于卵 周隙的精子已发生了顶体反应。e. 体外受精 2h 、 6h 后与单个卵 子发生融合的平均精子数f，与卵子发生融合的精子被Hoechst33342特异性标记，箭头所指为融合的精子图3. Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育 Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育图3. Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育 Izumo基因缺陷导致小鼠雄性不育

配子融合通常分为两个阶段：首先是精卵质膜的结合， 然后才是二者的真正融合。不论是 Izumo+/ - 还是 IzumoIzumo+/Izumo-/- 精 子都可以与用机械法去除透明带的卵子的质膜顺利结合 [13] （图3 e，f），利用此系统让Izumo+/ -或IzumoIzumo+/Izumo-/-精子和卵子 分别孵育2h或6h后，发现与单个卵子发生融合的精子数目， Izumo+/ -者分别为4.5和6个；而IzumoIzumo+/Izumo-/-者并未发生融合。 精子只有在发生顶体反应之后才能与卵子融合[14]，为了 确证 IzumoIzumo-/- 精子顶体的状态，我们利用 MN9 单克隆抗体 （MN9只能与已发生顶体反应精子的赤道段结合[15]）来标记 聚集在卵周隙中的精子。标记结果显示， IzumoIzumo-/- 精子已发 生了顶体反应，但却不能与卵子融合。因为 IzumoIzumo-/- 雄性小鼠没有子代，所以，我们不能确定 Izumo 基因缺陷是否会对融合之后的其他发育事件产生影响。 为了解答上述问题，我们采用单精子胞浆注射法（ICSI）， 跨 越 精 卵 融 合 的 障 碍 [16] ， 将 IzumoIzumo-/- 精 子 直 接 注 射 入 Izumo+/+ Izumo+/+卵子的胞质中，注射后的卵子被正常激活，将受精 卵移植入假孕鼠的输卵管，所得鼠胚的比例与Izumo+/ -精子 Izumo+/对照组比例大致相当（表1）。 表1. IzumoIzumo-/-精子ICSI后卵的发育通常，精卵融合的特异性不如精子透明带互作的特异性 强。例如，人类精子不能穿透仓鼠卵子的透明带，但却能与 去透明带的仓鼠卵子发生融合。利用这一实验模型（去透明 带仓鼠卵子的精子穿透实验）可估计人类精子的生育力[17]。 利用该实验模型，我们首先分析了小鼠的Izumo基因对精卵 融合的影响。图4，a的结果表明，无论是小鼠精卵之间的同 源融合还是与去透明带仓鼠卵子之间的异源融合，小鼠 Izumo 都是必须的；无独有偶，如果将抗人类 Izumo 的多克 隆抗体加入到人类精子与去透明带仓鼠卵子的孵育液中，则 不能观察到精卵的融合现象，而如果加入作为对照的 IgG ， 则可以观察到精卵的融合现象（平均每个卵子与5.9±0.7个 精子发生融合，总观察卵数分别为23和29，n=3）。这些结 果显示人类 Izumo 基因参与了与去透明带仓鼠卵子融合的过 程（图 4 ， b ），但是，还需要更进一步的实验来证明人类 Izumo基因在人类精卵融合中的作用。A.去透明带的仓鼠卵子分别 与 Izumo-/- 及 Izumo+/- 精 子 体 外 孵 育 6h 后 ， 用 Hoechst33342标记； b.加入抗人类Izumo抗体的人 类精子与去透明带的仓鼠 卵子共同孵育，结果没有 发生精卵融合。箭头所指 为 被 Hoechst33342 标 记 的 膨胀的已发生融合的精子 头部。IgG为对照实验。图4. Izumo与异种精卵融合考虑到基因剔除小鼠的表型有时也会由于靶基因旁序列 的破坏而造成 [18] ，为了验证IzumoIzumo-/-精子的表型缺陷是否直 接 由 Izumo 的 缺 失 所 引 起 ， 我 们 设 计 了 一 个 挽 救 实 验 （ rescue experiment ） ， 将 IzumoIzumo-/- 小 鼠 与 睾 丸 特 异 性 calmegin 启动子驱动表达 Izumo 的转基因小鼠品系杂交。结 果表明，通过转基因Izumo表达的恢复，IzumoIzumo-/-小鼠精子的 生育表型得以恢复（附件图1）。 目前的研究结果表明，有若干候选基因，其表达产物是 与 精 卵 融 合 过 程 密 切 相 关 的 精 子 膜 蛋 白 ， 例 如 DE[19] 、 CD46[20]、equatorin[15]、sperad[21]以及SAMP32[22]等均有见 报道。其中，ADAM蛋白家族由于其具有潜在的融合肽加工 位点（ ADAM1 ）以及具有去整合素（ disintegrin ）结构域 （ ADAM2 、 ADAM3 ） [23] 而备受关注。虽然在 ADAM1a 、 ADAM2、ADAM3的基因缺陷小鼠中并没有发现明显的精卵 融合的障碍[7,8,24]，但精子与透明带的结合能力均肯定受到损 害。与此相似，CD46的基因剔除小鼠也没有融合缺陷[6]。另外，从卵子的角度来看，卵子的膜蛋白CD9是精卵融[2-4]，一些实验结果提示，精子可能通过以整合素 合所必须的[2与 CD9 的结合来参与精卵融合过程，其中整合素α 的结合来参与精卵融合过程，其中整合素α6 、整合素 β1 被认为是最有可能参与精卵融合过程的候选基因。然 而，对基因剔除模型的研究表明，上述两个基因的缺陷并未 对精卵融合发生实质性的影响[25]。于是，流行多年的关于受 精机制的一个个假说，不断地被基因缺陷实验的结果所推翻。 这就启发我们，对某一个候选基因，只有通过观察其基因缺 陷小鼠的表型变化后，才能对该基因的本质加以判断。从这 个意义上说， Izumo是第一个真正显示出在精卵融合中具有 本质作用的精子膜蛋白。

但是目前还不能肯定 Izumo 是否能与 CD9 发生相互作 用，就像胎盘的 IgSF 蛋白 PSG17 一样 [26] ；我们也不知道为 什么顶体反应后，Izumo 蛋白的定位并不局限于精卵融合的 初始部位—— 精子赤道段。我们所能预料的是，对Izumo蛋 白的进一步研究，毫无疑问会让我们对精卵融合甚至是其它 体细胞（如肌细胞和滋养层细胞等）的融合过程的理解更加 深刻、全面。 此发现不仅让我们得以洞见精卵融合过程中，那谜一般 的融合机制，而且对不育症的临床治疗和新的避孕措施的开 发提供了潜在的效益。 The endThe end课题分析从前，早在1987年的时候……Okabe, M. et al. Effect of a monoclonal antianti-mouse sperm antibody (OBF13) on the interaction of mouse sperm with zonazona-free mouse and hamster eggs. J. Reprod. Immunol. Immunol. 13, 211– 211–219 (1988).小鼠各大器官 小鼠精子匀浆萃取 免疫组化定位 IAM抗体对照 免疫动物 Western BlottingC57BL/6精子抗原 小鼠精子体外获能 C57BL/6小鼠免疫 小鼠精子顶体反应 单克隆抗体OBF13 小鼠卵母细胞 小鼠卵去除透明带精子粗提蛋白Izumo抗体 Izumo重组蛋白基因工程OBF13 抗体2D蛋白电泳 Western Blotting 目标条带酶切液相串联质谱Izumo 基因基因打靶 转基因挽救OBF13 抗体体外受精阻断免疫抗受精肽段氨基酸测序生物信息学Izumo 缺陷小鼠基因型鉴定 相关基因检测Izumo蛋白定性OBF13抗原可能介导精子与卵膜的融合生育能力试验 体外受精试验 精卵融合试验Izumo 基因及其功能研究技术路线Izumo 基因及其功能研究实验结果• Izumo 是膜联免疫球蛋白家族的一员，特异表达于精子 ——Izumo ——Izumo 可能在细胞黏附方面有作用Izumo 基因及其功能研究实验结果• Izumo 是膜联免疫球蛋白家族的一员，特异表达于精子 ——Izumo ——Izumo 可能在细胞黏附方面有作用 • Izumo 抗体标记于顶体反应精子的顶体区 ——Izumo ——Izumo 蛋白定位于顶体内膜上

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Izumo 基因发现之后？• Izumo 并非定位于赤道区 Izumo -/- 精子可与卵母细胞膜结合 ——介导精卵识别的可能不是 Izumo，是谁？ • 细胞融合是膜分子间的相互作用 —— Izumo 的互补分子是谁？ • 卵母细胞膜的精卵融合的必要蛋白是CD9 —— Izumo 与 CD9是什么关系？Goodbye !免疫球蛋白超家 族成员 Izumo 是精卵 融合的必要蛋白！