[茶多酚对大鼠慢性缺氧损伤保护的实验研究]新生大鼠缺血缺氧模型

　　摘要：大鼠在高原环境模拟舱内间断缺氧及注射CoCl2溶液以建立红细胞增多症模型，实验分4组：平原组、慢性缺氧组、高剂量TP+慢性缺氧组、低剂量TP+慢性缺氧组，研究茶多酚对慢性缺氧诱导的大鼠红细胞增多症及心肌缺氧损伤的影响，结果显示，茶多酚能够显著抑制缺氧大鼠的红细胞数、血红蛋白和红细胞压积的增加，降低骨髓增生程度，减小缺氧大鼠心室重量指数，增加缺氧大鼠Hermannnwillson指数，同时经茶多酚处理的缺氧大鼠心肌损伤程度较单纯缺氧组轻，提示，茶多酚对大鼠红细胞增多症有一定的预防作用，同时茶多酚还能减轻慢性缺氧对大鼠的心肌损伤程度。
　　关键词：茶多酚；缺氧；红细胞增多症；心肌损伤
　　中图分类号：R364.4　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0268－05
　　
　　茶多酚(tea polyphenols，TP)是从茶叶中提取的多酚类物质，是茶叶的重要风味物质及生理活性成分，作为一种高效低毒的天然抗氧化剂，目前在食品工业中已得到广泛应用，除抗氧化作用外，临床及实验研究还发现TP可有效降低高血压、冠心病、恶性肿瘤、胃肠道疾病等多种患者血液的全血粘度、血浆粘度、红细胞压积等参数，改善血液流变及微循环，抑制患者血液高粘滞状态，从而避免了疾病的恶性循环，慢性缺氧可致红细胞增多症，高原缺氧所致高原红细胞增多症是一种常见的慢性高原病，多种疾病如慢性阻塞性肺病以及某些先天性心脏病等均可因机体缺氧导致红细胞增多症的产生，红细胞增多症患者红细胞过度增生，血液流变异常，血液具有浓、粘、聚的特点，此外，慢性缺氧和红细胞增多症还可引起全身多器官、组织损害，如心肌损伤，本研究运用低压性缺氧复合CoCl2复制大鼠红细胞增多症模型，探讨茶多酚是否对缺氧引起的红细胞增多症和心肌损伤具有预防和保护作用。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1　实验动物
　　Wistar大鼠，雄性，体质量180～200g，SPF级，购于本校附属大坪医院动物所。
　　1．1．2　主要药品
　　茶多酚(tea polyphenols，TP)：纯度98％，其中儿茶素含量80％，表没食子儿茶素没食子酸脂(Epigaltocatechin gallate，EGCG)含量45％，购于浙江东方茶业科技有限公司。
　　1．1．3　器材
　　乙二胺四乙酸二钾盐(Ethylenediaminete-traacctic acid-djpotassium salt，EDTA-K2)真空采血管为山东威高集团公司生产，全功能自动血流变仪为北京(普利生)LBY-N6B型，自动血细胞分析仪为日本Sysmex-21型。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　动物饲养
　　标准大鼠饲料，购于本校附属大坪医院动物所，自由进食、进水，尤其保证充足饮水。
　　1．2．2　实验分组及给药
　　50只大鼠用随机排列表分成4组：对照组(平原组，海拔221m，n=8)、慢性缺氧组(n=14)、TP(20mg/kg.bw)+慢性缺氧组(高TP组，n=14)、TP(10ms/kg.bw)+慢性缺氧组(低TP组，n=14)，每两天一次皮下注射TP，平原对照组和慢性缺氧组给等量消毒蒸馏水。
　　1．2．3　红细胞增多症动物模型复制
　　慢性缺氧组、高TP组、低TP组置于高原环境模拟舱中，5000m、12h/d，40d；每两天一次腹腔注射CoCl2溶液5.5mg/kg.bw(单日给CoCl2，双日给TP)，模型复制结束时，在模拟高原4000m的低压氧舱内采取动脉血和取材。
　　1．2．4　取样及红细胞数、血红蛋白和红细胞压积测定
　　20％乌来糖麻醉后，经颈动脉导管取血，ED-TA-K2抗凝，然后用三分类血液分析仪测定大鼠血中红细胞数、血红蛋白和红细胞压积等值，采取动脉血后，立即取心、骨髓等组织备用。
　　1．2．5　骨髓涂片制作
　　取大鼠股骨骨髓制作涂片，并进行瑞氏染色，骨髓增生分级标准见表1。
　　
　　1．2．6　心肌肥大的判定指标
　　左心室重量指数(left ventricle weight index，LW)：(左心室重量+室间隔重量)／体重，右心室重量指数(right ventricle weight index，RW)=右心室重量／体重，Hermannwillson指数(Hermannwill-son index)=(左心室重量+室间隔重量)／右心室重量。
　　1．2．7　心肌病理切片制备
　　取右心室肌制作病理切片，HE染色，参照Rona等标准将心肌病理损伤分为4级，0°心肌无病变：肌纤维排列整齐，横纹清晰，胞核明显，无细胞肿胀：I°心肌出现散在性点状坏死伴炎性细胞浸润，主要为凝固性坏死灶，局限于心内膜下；Ⅱ°心肌坏死灶呈片状分布，灶间五连接，肌纤维肿胀和断裂，病变累及心壁全层；Ⅲ°心肌广泛性大片状坏死，灶间相互连接累及心壁全层；Ⅳ°遍及整个心脏的融合性损伤，包括梗死样的广泛坏死，偶有急性动脉瘤或附壁血栓，按心肌病变级别对心肌损伤程度进行统计。
　　
　　1．3　统计学处理实验各组样本数n≥7，数据以x±S表示，采用统计软件SPSSl2.0进行方差分析，或计数资料采用非参数检验：nemenyi秩和检验。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　大鼠体征及症状
　　与正常组相比，各实验组大鼠精神状态较差，部分大鼠唇周、耳色黯红，鼻、眼有出血现象，个别严重者畏寒少动、反应迟钝、被毛蓬松无光泽，而这些情况在单纯低压缺氧组更为明显。
　　
　　2．2　红细胞数、血红蛋白和红细胞压积
　　观察血液样本，可见缺氧组大鼠血液呈暗红色，非常浓粘，而TP组血样则有明显改善，测定结果见表2，结果显示，缺氧使大鼠红细胞数、血红蛋白和红细胞压积值均显著增加，TP则能够显著抑制缺氧大鼠的红细胞数、血红蛋白和红细胞压积的增加，且高剂量TP的作用大于低剂量TP。
　　　　
　　2．3　骨髓增生情况
　　骨髓涂片显示，慢性缺氧模型组全骨髓增生明显或极度活跃，以红系增生为主，大多有粒红比下降，TP处理组骨髓增生程度均明显降低，极度活跃骨髓相明显下降，而增生活跃或明显活跃的比例上升(P＜0.05)，但高TP组与低TP组间无显著差异(P＞0.05)，见表3，说明TP可降低慢性缺氧大鼠的骨髓增生程度。
　　　　
　　2．4　心肌重量指数
　　由表4可见，缺氧对照组和TP组大鼠LW和RW值均有增加，但TP组却明显低于缺氧对照组(P＜0.05)；低TP组RW值高于高TP组(P＜0.05)，而LW值无明显差异；各实验组Her- mannnwillson指数明显降低，但TP组却明显高于缺氧对照组(P＜0.05)，慢性低压缺氧加CoCl2处理使大鼠左右心室均发生肥大，右心室肥大较左心室程度高，而TP可以减轻心室尤其是右心室的肥大程度。
　　　
　　2．5　心肌病理切片
　　对照组，心肌无病变；缺氧对照组，血管充 血，心肌纤维间有少量点状出血，间质少量炎细 胞，心肌纤维间隙增宽，主要呈灶性或点状心肌细胞变性溶解，有空泡变或波浪变，心肌损伤分级有Ⅰ°、Ⅱ°、Ⅲ°，以Ⅱ°为主，TP处理组的心肌损伤程度均较单纯缺氧组轻(P＜0.05)，见表5和图1、图2。
　　　
　　3 讨论
　　
　　慢性缺氧导致红细胞代偿亢进而过度增生，血液粘滞度增高，同时缺氧时红细胞变形性下降，使血液达到高凝状态，反而加重组织器官郁血、缺氧，形成恶性循环，导致红细胞增多症的发生，COCl2可使组织细胞发生缺氧，而红细胞代偿性增加，本实验参考姜平等人的方法，运用低压舱模拟海拔5000m高度和注射CoCl2溶液复制出红细胞增多症动物模型，同时用茶多酚(TP)对实验组进行处理，结果显示茶多酚可显著降低实验大鼠的红细胞数、血红蛋白值和血球压积，同时可减小缺氧大鼠心室重量指数，增加缺氧大鼠Her-mannnwillson指数，以及减少心肌损伤程度，提示茶多酚有预防或抑制缺氧大鼠发生红细胞增多症的作用，以及对心肌缺氧损伤有保护作用。
　　一般认为，人类高原细胞增多症的诊断标准是红细胞大于6.5×1012、血红蛋白大于200g/L、红细胞压积大于65％，但未见相应的大鼠红细胞增多症诊断标准报道，本课题造模大鼠红细胞数为10.76±0.68，血红蛋白224.4±13.9。红细胞压积0.733±042，显著高于对照组，参考人类高原细胞增多症的诊断标准，结合造模大鼠的临床症状，我们认为本实验的动物模型复制方法是可行的。
　　组织缺氧可通过激活黄嘌呤氧化酶系统使自由基增多，使体内脂质过氧化反应增加，自由基的增多使红细胞结构和功能发生异常，膜流动性和变形能力降低，TP是含有两个以上互不相邻的羟基多元酚，是很好的供氢体，有很强的抗氧化作用，体外研究表明，TP对离体的红细胞氧自由基损伤有显著的抑制作用，可保护体外黄嘌呤氧化酶、过氧化氢和紫外线照射等自由基产生体系诱导的红细胞膜脂质过氧化损伤，维持红细胞膜的结构完整性和正常功能，人体研究也发现，TP能排除在高原产生的体内大量氧自由基，提高氧利用率。增强人体对高原的耐力，促进高原习服，TP可以降低血浆纤维蛋白原，稳定抗凝血酶Ⅲ活性，改善动脉内皮损伤，抗血小板凝聚，从而具有抗凝血、促纤溶作用，这可能也是缺氧大鼠的血液流变及微循环改善的重要原因之一，而血液流变及微循环的改善使组织供氧得到改善，本实验发现TP可降低慢性缺氧大鼠的骨髓增生程度，导致红细胞增生受到抑制，可能是红细胞数量减少的重要原因，虽然红细胞数量减少，但由于TP同时具有保护红细胞结构和功能的作用，以及血液流变和微循环得到改善，因而氧的运输和利用率得以提高，上述因素可能在TP抑制缺氧大鼠红细胞增多症的作用机制中有重要意义。
　　缺氧导致红细胞生成素(ervthropoietin，E-PO)水平增高是高原红细胞增多症发病的关键因素之一，缺氧时EPO合成增加50～100倍，E-PO是红细胞生成所必需的细胞因子，它通过红细胞生成素受体依赖途径，刺激红系祖细胞有丝分裂，导致红细胞大量产生，因此，EPO可能在TP对缺氧大鼠红细胞增多症的抑制作用中发挥重要作用，这也是我们将在下阶段工作中探讨的内容。
　　慢性缺氧引起肺动脉高压是导致心脏肥大和心肌受损的主要环节，同时慢性低氧血症引起心肌供血不足和红细胞增多症也是心肌损伤的主要因素，TP作为抗氧化剂，可通过清除自由基而减轻心肌细胞损伤，由于TP可抑制红细胞增多症的产生，血液粘度减低，可能通过缓解冠脉供血不足，使心肌肥大、梗死的程度减轻；同时，由于红细胞容量减少使缺氧大鼠的总血容量减少，减少了心脏前负荷，可能也对心肌损伤有一定保护作用，有人发现TP可以通过上调心肌组织的Na-K-AT-Pase活性，改善心肌能量代谢，抑制心肌肥大损伤，因此，茶多酚可能主要通过抑制红细胞增多症和对心肌组织的直接保护作用，发挥其减轻缺氧大鼠心肌损伤的作用。
　　
　　作者简介：罗红(1970－)，女，四川省大竹人，第三军医大学讲师，博士研究生，主要从事高原营养学方面的研究。