ＡＢＩ　１７００芯片分析系统在基因差异表达研究中的应用 cgh芯片分析系统

　　丁大鹏　马文丽　石　嵘　周珏宇　郭秋野　郑文岭 　　摘要：应用化学发光法标记技术分别对正常和临床慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia.CML)病人骨髓单个核细胞的RNA进行标记，然后与ABI的人全基因组表达谱芯片杂交，对于杂交后所得到的荧光信号数据，应用1700芯片分析系统对其进行生物信息学分析，实验结果表明，ABI1700芯片分析系统可以对基因芯片杂交后得到的差异表达基因进行疾病学分类和生物功能分类分析，同时还发现与CML相关的差异表达基因75个，因此ABI 1700芯片分析系统在芯片研究领域中具有重要的应用价值。
　　关键词：ABI 1700芯片分析系统；差异表达基因；慢性髓细胞性白血病
　　中图分类号：R-331
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)02-0134-05
　　
　　基因表达谱芯片作为一项高灵敏度、高通量、平行化检测基因表达的生物技术，目前在分子生物学研究领域得到广泛应用，通过对芯片所得到的数据进行统计学分析，找出实验所感兴趣的基因表达改变，从而在分子水平上对相关基因的生物学功能进行阐述，但是由于统计学方法的多样性以及芯片种类本身对数据处理方法的要求存在偏差，在芯片实验之后，往往需要投入比较多的时间和费用对所得到的差异基因的生物学功能进行比较系统和科学的研究，ABI1700芯片分析系统是商品化的、基于生物芯片实验室的芯片分析系统，通过完整的芯片实验流程，可在全基因组水平上对差异表达基因的生物学功能进行综合分析，本实验选用ABI1700全基因组表达谱芯片分析系统对正常人和慢性髓细胞性白血病病人的骨髓单个核细胞的基因表达差异进行分析，来探索这一基于生物芯片实验的芯片分析系统在基因表达差异研究中的应用。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1材料
　　慢性髓细胞性白血病的骨髓样品由广州军区总医院血液科提供，同时与之对照的是同年入院患者的正常骨髓样品，1700芯片分析系统由美国ABI生物公司提供，实验中所用的芯片和相关试剂均由系统本身所附带，总RNA提取试剂(Tri-zol)及PCR产物纯化试剂盒购自上海博彩生物工程公司；mRNA纯化试剂盒购自Pharmacia公司；逆转录酶SuperScriptⅡ购自Gibco公司；E.coli聚合酶I、Rnase H、Taq酶及其他常用酶类购自TaKaRa公司。
　　
　　1.2样品制备
　　1.2.1细胞总RNA的提取
　　分离骨髓样品，按照Trizol法提取细胞的总RNA，具体操作步骤参照文献，并采用AgilentBi0Analyzer 2100进行RNA样品的质量检定。
　　1.2.2逆转录合成cDNA
　　两个标本各取总RNA2μg，加入5μLT7启动子引物，加无核酸酶水至总的反应体积为11.5μL，65℃水浴10min，冰上放置5min，然后加8.5trL cDNA Master Mix(含5×第一链缓冲液4μL，0.1mol/L DTT 2μL，10mmol／LdNTP混合物1μL，逆转录酶MMLV1 μL，RNA酶抑制剂0.5μL)，40℃水浴2h后，65℃15min灭沽MMLV-RT，冰上孵育5min。
　　1.2.3 CRNA合成与标记
　　合成好的CDNA样品应用地高辛标记试剂盒按照线性扩增流程，在合成CRNA的同时，进行底物的地高辛标记，生成标记有地高辛的CRNA。
　　1.2.4荧光标记CRNA的纯化
　　在cRNA标本中加入20 ILL无核酸酶水，350μL RLT缓冲液，混匀后加入250μL无水乙醇，完全混匀，将混匀后的cRNA样品转移到RNeasy微型纯化柱，并将该纯化柱置于2mL收集管中以13000r/min离心30s，弃滤出液和收集管，将纯化柱转移到一个新的收集管中，并向纯化柱中加入500μL的RPE缓冲液，以13000r/rain离心30s，弃滤出液，再向柱子中加入500μL的RPE缓冲液，以13000r/min离心60s，弃滤出液，将纯化柱转移到一个新的1.5mL收集管中，在纯化柱滤膜中央加入30μL的无RNA酶水，室温放置60s后，以13000r/min离心30s洗脱纯化的cRNA样品，重复以上洗脱步骤一次，最终滤出的总体积大约为60μL，BeckmanDU530紫外分光光度仪测定样品的浓度后，-80℃遮光贮存，纯化后的CRNA即可用于芯片杂交。
　　
　　1.3芯片杂交、洗片和扫描
　　按照ABI公司化学发光检测试剂盒的操作流程进行样品与芯片的杂交，然后选择用ABll700系统自带软件来进行芯片扫描和数据分析。
　　
　　2结果
　　
　　1)RNA质量控制结果，使用Agilent2100生物分析仪鉴定两份样品的RNA质量，1为对照样品，2为CML病例样品，如图1所示，RNA样品均没有明显降解，符合芯片测定要求。
　　2)芯片杂交结果，芯片周边以及内部的阳性对照点信号清晰，杂交信号强度高，亮度好，并且杂交结果中的背景信号比较小，信噪比高，如图2、3所示。
　　3)通过两样本T检验来筛选差异基因，P值小于0.01有统计学差异，并应用假阴性率(FalseDiscovery Ratio，FDR)的P值来对T检验结果进行调整，共筛选出差异表达基因6706个，应用ABI 1700芯片分析系统对差异表达基因进行相关疾病和生物学功能分类与分析，首先应用Pan―ther生物学软件对得到的差异基因进行生物学功能分析，即将差异表达基因所在的生物学功能进行分类，见表1；然后对其中与CML相关的差异表达基因用Jubilant软件进行病理疾病筛选，如表2所示，
　　4)对筛选得到的差异表达基因，应用1700芯片分析系统分析不同生物代谢通路中的差异基因，将基因归到具体代谢通路中进行研究，如表3所示。
　　
　　3讨论
　　
　　表达谱基因芯片的出现为检测整个基因组的表达信息提供了一个极为有利的工具，通过对成千上万基因表达进行平行分析，获得了大量的数据，如何进一步分析其潜在的生物学信息，是当前一项具有重要意义的研究工作，目前结合生物信息学的基因芯片数据分析已经成功应用到许多领域，比如肿瘤基因的突变研究和药物靶点的筛选等，但是从数据分析操作的过程来看，在处理和分析数据的具体步骤中仍然存在许多不精确的地方，基于芯片实验的1700生物分析系统，能够更科学、更快速地对芯片所得到的基因数据进行系统的分析和多角度的研究，1700芯片分析系统应用基因表达谱芯片在检测人或者小鼠全基因组表达丰度的同时，还可以对正常和疾病的组织或者细胞中的差异表达基因进行相关的验证实验， 　　与一般的芯片研究和数据分析相比，1700芯片分析系统具有更高的准确性和重复性，系统采用地高辛对样品进行标记，然后应用化学发光原理对杂交信号亮度进行检测，由于化学发光法检测的高灵敏度，起始总RNA量最少只用500ng就可以进行标记反应，样品mRNA在进行线性扩增反应的同时，合成标记有地高辛的cRNA，系统应用Agilent2100生物分析仪对提取和标记好的RNA质量进行检定，保证用于芯片杂交样品的稳定性和完整性，1700芯片分析系统中芯片点阵的每一个探针都对应于Celera数据库中的一个基因序列，序列本身已经在NCBI的基因组注释项目公布的参考序列(REFSEQs)中予以确证，从而使得芯片杂交反应后得到数据的可信度更高，本实验以正常人和CML患者的骨髓单个核细胞的RNA样品进行分析比较，从清晰的毛细管电泳图上可以看出，RNA的质量基本符合基因芯片测定的要求，从而在此基础上进一步对基因的表达差异进行研究。
　　对于芯片得到的大量丰富的数据，1700芯片分析系统立足于Celera数据库对差异表达基因进行相对应的数据分析和生物信息学处理，结合附带的生物学软件对芯片数据进行科学的统计分析，从本实验结果来看，首先应用Panther生物学分类软件，将6706个差异表达基因按照已经研究的生物学功能进行分类，从而对差异表达基因的种类有一个比较全面的了解，针对每一种生物学功能，还可以结合每个差异基因具体表达量的多少，来对其进行进一步的研究，而本实验的处理样品是采自CML患者的骨髓单个核细胞，因此需要探讨差异表达基因中哪些是与CML疾病发生发展过程有关的，从1700芯片分析系统附带的Jubilant病理／疾病分类软件分析结果来看，共发现有75个基因与CML相关，并且相关可信度具有统计学意义，除此之外，对差异表达基因进行了更深入地分析，来研究其在代谢通路上的作用和相互关系，系统根据目前基因组学的研究，提供不同的代谢通路并将具体的差异表达基因在其中的分布做了统计图表，以方便根据实验的需要来进行多层面的分析，同时1700芯片分析系统针对每个基因还配对相应的TaqMan探针来进行后面的验证实验。
　　1700芯片分析系统提供了从芯片到芯片信号的采集和分析，以及表达量验证的完整性工作，从而使得芯片实验结果的可信度大大提高，而且对于得到的大量数据，系统本身具有强大的数据库和分析软件为基础，不仅可以对差异表达基因进行生物学分类，还可以针对其不同的代谢通路上的具体作用机制进行深入分析研究，为芯片数据分析的合理化提供了新的思路，同时，由于实验本身是在一个完整的系统中进行并完成的，在一定程度上也减少了芯片实验的费用，因此有助于基因表达谱芯片技术在基因功能学研究领域得到进一步的广泛应用。