[7.脱氢酶活性测定] 脱氢酶活性测定
实验（七） 脱氢酶活性测定
脱氢酶的正式命名应是AH：B氧化还原酶，它能酶促自一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶广泛存在动植物组织和微生物细胞内。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定活性污泥或土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对污泥或土壤中有机物氧化分解能力，即污泥酶或土壤酶的活性。
利用已知受氢体能接受脱氢酶脱出的氢原子，如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride）,俗称红四唑，接受氢后变成红色的三苯基甲臜（TF，triphenyl formazan）,根据产生红色的色度进行比色定量分析，以判断脱氢酶活性。
TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示。
H H N-N-C6H5 N-N-C6H5 - C6H5- +2e+C6H5 - +HCL + +2H N=N-C6H5 N=N-C6H5 CI
(无色TTC) (红色TF)
根据红色的深浅，测出相应的吸光值（A值），求出脱氢酶的活性。通常A值越大（红色深），脱氢酶活性越高。
1．1 材料与方法
(1)材料 活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。
(2)方法 分光度法。
要点①所有操作应当尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应条件，温度30～37℃,PH 值7.4～8.5。
②取用甲醛时要小心，不要碰到皮肤上，如若沾到皮肤上要迅速用自来水
冲洗。
2．2 实验步骤
（1）绘制TTC标准曲线
①配制系列浓度的TTC标准溶液。先取5支50mL带塞比色管，按顺序尽快分别加入0.36％Na2So3溶液2.5ml，Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）7.5mL在分别
吸取0.4％TTC 溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL,放入5支比色管中，用蒸馏水定容至50mL,使成8μg〃mL-1、32μg〃mL-1、40μg〃mL-1系列浓度。同时另取一支50mL比色管，加入0.36％Na2SO3溶液2.5mL,Tris-HCl缓冲溶液（pH
值7.6）7.5mL,加入蒸馏水至50mL,作为空白对照。
②向每支比色管中各加入少许（十几粒）连二亚硫酸钠（Na2SO4）混匀，使
TTC全部还原成红色的TF(三苯基甲臜)。
③向各管滴加5mL甲醛终止反应，摇匀后加入5mL丙酮振荡摇匀，37℃水浴10分钟。
④在485㎜波长下测定吸光值A。
⑤以A值为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。
（2）活性污泥脱氢酶活性的测定(略)
①活性污泥悬浮液的制备 取50mL活性污泥液（约1.5～3g〃L-1）放入三角瓶中，加入数粒玻璃珠剧烈摇动将污泥打碎。40000r.min-1离心5min,弃去上
清液，再用生理盐水补充水分，悬浮，洗涤，离心，反复三次。最后用生理盐水补至原体积。
②取4个40mL据塞离心管(1个对照，3个平行)，分别加入Na2SO3 溶液0.5ml，
Tris-HCL缓冲液（PH值7.6）2.0ML，污泥悬浮液2mL，0.4％TTC液0.5mL(对照管不加TTC液，以0.5mL蒸馏水取代），使最终体积都为5mL,盖紧塞子。
③将离心管摇匀，立即放入37℃水浴中培养10分钟（以显色为准）。 ④各管分别加入0.5mL甲醛终止反应。再向各管分别加入5mL丙酮振摇数十次，37℃水浴保温10分钟。
⑤4000r.Min-1离心5分钟，取上清液在485nm波长下测定A值并在标准曲线上查出相应得TTC浓度。
（3）土壤脱氢酶活性的测定
①取3个50mL具塞比色管，分别称取通过2mm筛的土样5g，加入比色管中，再加入5mL0.4％TTC液，另取一个50mL具塞比色管加入同种土样的灭菌土5g，也加入5mL0.4％TTC液，作为对照。
②将以上4个具塞比色管避光，37℃水域锅中保温培养12～24h。
③培养结束后，加入5mL甲醛终止反应，再分别加入5mL丙酮振荡并在37℃保温10分钟，转入离心管。
④4000r.min-1离心5分钟，取上清液在485nm波长下测定A值，在标准曲线上查出相应的TTC浓度。
3．3结果与讨论
（1）脱氢酶活性的计算
脱氢酶活性=ABC （6-5）
式中，A为由标准曲线上查出的TTC浓度，(μg.mL-1);B为培养时间校正值（h）;C为比色时稀释倍数，当A值大于0.8时，要适当稀释，使A值在0.8以下。
（2）影响脱氢酶活性的因素有哪些？
（3）已知乳酸脱氢酶（LDH）在DAD+的递氢作用下，是乳酸脱氢生成别丙酮酸。丙酮酸在碱性溶液中与2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙使溶液呈
棕色。颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。
要点 丙酮酸标准溶液配制——称取丙酮酸钠11mg，用0.05mol.L-1硫酸溶解后，定容至100mL，置冰箱中保存。