中国樱桃花粉总ＲＮＡ的提取|车厘子苗价格表
摘要：本文采用了CTAB法从中国樱桃花粉中快速提取RNA，既快速简洁，又可获得高质量的RNA，可满足花粉中特异表达基因(如SFB基因)的克隆和鉴定的需要。 关键词：中国樱桃；花粉总RNA；SFB基因
中图分类号：S662.5 文献标识码：A 文章编号：1002－2910(2008)02－0016－02
自交不亲和的分子生物学已成为当前国际上植物分子生物学研究的热点之一。目前已经对花柱中控制自交不亲和性的S-RNase基因进行了分离和鉴定，花粉特异表达的SFB基因的研究开展得较晚，克隆花粉SFB基因已成为自交不亲和性分子机理研究的重点。克隆花粉中特异表达的基因，必须首先提取出高质量的花粉总RNA，但由于花粉中具有较高含量的蛋白质和多糖，影响了其RNA的提取。本文探讨了花粉RNA提取方法，获得了高质量的花粉RNA。
1 材料与方法
1.1 材料
花粉的采集。试验于2006年3月下旬在田间成龄大树上进行。取中国樱桃“泰小红樱”、“莱阳矮樱”的铃铛花，带回室内，用镊子剥取花药，待花药阴干后收集花粉于小塑料袋内，液氮速冻后放于-76℃低温冰箱中保存待用。
1.2 花粉总RNA的提取及检测
花粉RNA提取采用CTAB法：①将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取缓冲液放在65℃水中温浴。②取2～3g新鲜或冷冻的花粉在液氮中研磨。③迅速将研磨好的花粉转入15ml十六烷基三甲基溴化铵提取液中，立即旋涡剧烈振荡30秒，再在65℃水中温浴3～5分钟。④加等体积的氯仿／异戊醇振荡混匀，再在室温下10000转／秒离心15分钟，转移上清液到另一离心管中，重复氯仿／异戊醇抽提1次。⑤转移水相到另一离心管中。根据溶液体积加入4moL/L的氯化锂，使氯化锂终浓度为2mol/L，4℃下过夜。⑥4℃下离心20分钟，去掉上清液，用50μl 70％的乙醇漂洗沉淀。⑦加入500μl SSTE溶解沉淀，将溶液转移到1.5ml离心管中加入等体积氯仿／异戊醇再抽提1次。⑧在上清液中加入2～2.5倍体积的乙醇，－70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时。⑨4℃离心(12000转/分)20分钟沉淀RNA。⑩70％的乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50μl焦碳酸二乙酯处理的双蒸水溶解沉淀。
电泳检测RNA。5×RNA电泳缓冲液的配制：80ml焦碳酸二乙酯水溶液，4ml、lmoL/L的醋酸钠，2g 3-吗啉丙硝酸(MOPS)，pH值7.0的氢氧化钠，1ml、0.5ml/L的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH值8.0)，定容到100ml。配制1.2％的琼脂糖凝胶(20ml)：称取琼脂糖0.24g，加入12.04ml焦碳酸二乙酯处理的双蒸水溶液，5×RNA电泳缓冲液4ml，微波炉中融化，冷却至55℃，加入1.96ml甲醛，冷却后倒胶。RNA电泳：取去离子甲酰胺10μl，甲醛1.5μl，10×RNA缓冲液2μl，RNA(2～4μg，＜10μl)混合液，65℃加热15分钟，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3μl RNA凝胶液和0.5μl溴化乙锭，上样电泳。电泳液为1×RNA液。
1.3 反转录eDNA第一链的合成
取2μg总RNA，加寡聚核苷酸引物1μl，补焦碳酸二乙酯处理的水溶液至12μl，70℃变性5分钟，立即在冰浴中放置5分钟，然后离心片刻。按表1在冰浴中依次加入各种成分。轻轻混匀后在42℃温浴60分钟，反应结束后在85℃水浴中放置10分钟以灭活反转录酶。加入180μl焦碳酸二乙酯处理的水溶液，稀释至200μl，混匀，稍后离心，保存于-20℃条件下。
1.4 SFB基因eDNA中间片段的扩增
对反转录的eDNA进行PCR扩增。反应体系(25μl)中含有10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/L的脱氧核糖核苷酸2.0μl，2.5mmol/L的氯化镁2.0μl，3个单位的Taq酶，上下游引物各0.2μmol/L，50ng cDNA模板。反应程序如下：94℃预变性3分钟，然后进行以下循环；94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测是否有适当大小的条带。
2 结果与分析
提取的RNA样品经电泳检测，结果见图1。可见提取的中国樱桃花粉RNA有3条清晰完整的带，分别为28S，18S，5SRNA，条带后面无明显的拖尾，既无降解，也无可见的DNA，说明用本法提取的RNA纯度高，质量好。
用CTAB法提取的中国樱桃花粉RNA，反转录后稀释10倍可用于SFB基因cDNA的克隆，对其中间片段的扩增，能得到适当大小的清晰谱带(图2)。
3 小结
用此法提取的花粉RNA质量和浓度都远高于Trizol法。此法更彻底除去了花粉中固有的大量蛋白质和多糖，不需要培养花粉使其萌芽，缩短了试验时间，更避免了此过程中花粉的污染及花粉中RNA的降解。实践证明，用此法可在短时间内制备大量的RNA，纯度高，降解少，完整性好，其质量完全满足花粉SFB基因的克隆和鉴定的需要。该法经多次重复验证，目前正用于花粉SFB基因的克隆和鉴定及表达研究。