小细胞肺癌死前的征兆_ＢＲＧ１在肺癌组织和肿瘤细胞系中表达下调原因初探

　　关勇军　蔡秀梅　李友军　何春梅　陈主初 　　摘要：前期的研究表明：在肺癌及多种肿瘤细胞系中，BRG1(brahma-related gene 1)的mRNA和蛋白质表达下调或缺失，但影响BRG1表达下调的原因并不清楚，因此，用PCR-SSCP(single strand conformation polymor-phism)方法检测18例肺癌组织和15株肿瘤细胞系DNA，并经测序证实：其中有1例肺癌组织的BRG1外显子25第3590位碱基存在T→C的点突变，其编码的BRGI蛋白第1171位氨基酸相应地由Val(缬氨酸)→Ala(丙氨酸)，该突变位于BRG1蛋白最重要的功能区(依赖DNA的ATP酶区)，提示BRG1突变在肺癌发生中可能起一定的作用，同时，对未检测到BRG1 mRNA表达的6例肺癌组织和9株肿瘤细胞系还进行了DNA甲基化分析，结果发现：这些肺癌组织和肿瘤细胞系中BRGI启动子区均无异常甲基化，这说明BRG1在肺癌中表达下调的机制尚需进一步研究。
　　关键词：BRG1；肺癌；突变检测；甲基化分析
　　中图分类号：R730
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)02-0153-05
　　
　　BRG1(fbrahma-related gene 1)是进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的成员之一，我们和其他人的研究均发现：在肺癌组织及多种肿瘤细胞系中，BRGI的mRNA与蛋白质表达下调或缺失，但影响BRGl在肺癌中表达下调的原因仍不清楚，我们采用PCR和PCR-SSCP方法对肺癌组织和多种肿瘤细胞系进行检测，为阐明BRG1在肺癌中表达改变的机制提供证据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1细胞与组织
　　永生化人支气管上皮细胞系HBE，肺鳞癌细胞系NCI-H520，肺腺癌细胞系A549，鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3、HONE1，宫颈癌细胞系Hela，喉癌细胞系Hep-2，肾癌细胞系RLC和肝癌细胞系SMMC由本室提供，18例原发性肺癌组织取自中南大学湘雅二医院经病理确诊且未经放疗和化疗的患者，其中肺鳞癌12例，小细胞癌3例，腺癌、腺鳞癌和大细胞癌各1例。
　　
　　1.2主要试剂
　　Toq DNA聚合酶(大连宝生物工程公司)，限制性内切酶Msp Ⅰ和HpaⅡ(MBI公司)，蛋白酶K、SDS(Sigma公司)，小牛血清、RPMI1640培基(GIBCO公司)，胰酶、ADNA/HindⅢ和PCRmarker、琼脂糖等(华美生物工程公司)，全部引物用Primer3软件设计，由上海生工生物工程公司合成，引物序列和产物大小见表1.1，3方法1.3，1 DNA抽提。
　　细胞／组织DNA的提取参照文献[6]的方法进行，1，3，2纯合性缺失检测。
　　以提取的组织和细胞系基因组DNA为模板，分别用6对引物PCR扩增STSI。6片段[7]，反应结果用琼脂糖凝胶电泳进行检测，1，3，3点突变检测fPCR-SSCP)。
　　以提取的组织和细胞系的基因组DNA为模板进行PCR反应，以鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA为模板扩增p53基因第8号外显子(已知CNE2细胞中p53基因外显子8第280位密码子存在G～C错义突变)，作为阳性对照，PCR产物与等量变性缓冲液(97％去离子甲酰胺，0，2 mmol／L EDTA，0，05％溴酚蓝，0，05％二甲苯青FF)混匀，99℃变性10 min，置冰上骤泠，迅速上样于8％-12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺=49：1，凝胶厚度0.4 mm)，4℃，200V，电泳10～12h，卸下凝胶，于固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)中浸泡10min，染色液(0.2％硝酸银)15min，蒸馏水漂洗2次，置显色液(0.75％NaOH和0.2％甲醛)中显色直至出现清晰的DNA条带，玻璃纸包裹凝胶，室温干燥保存。
　　1.3.4甲基化分析
　　甲基化分析采用Kane等描述的方法进行，已知BRGl表达下调的6例肺癌组织和9株肿瘤细胞系基因组DNA采用常规蛋白酶K消化、酚／氯仿抽提，1μg基因组DNA分别用100u的HpaⅡ或200 u的Msp I，37℃消化过夜，酶切产物纯化后，取40ng纯化的酶切产物用于PCR扩增，未消化的基因组DNA作对照，30μL PCR反应体系：1xPCR缓冲液、0.2 mmol／LdNTPs、1uTaq酶、0.4 txmol／L甲基化分析引物，94℃5 min预变性，94℃50 s、55℃50 s、72℃50 s，30个循环，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　
　　2实验结果
　　
　　2.1纯合性缺失检测
　　为探讨BRGl是否因纯合性缺失而影响其表达，用分别针对BRG１基因内部6个STS(se－quence tagged site)的6对引物，对18例肺癌组织和15株肿瘤细胞系的基因组DNA进行了PCR扩增，结果经琼脂糖凝胶电泳检查，在所有检测的肺癌组织和肿瘤细胞系中未发现有BRGl基因的纯合性缺失(见图1)。
　　
　　2.2点突变检测
　　同时，我们还用PCR-SSCP方法检测了18例肺癌组织和15株肿瘤细胞系中BRG1外显子4、7、10、19、25、26、34的点突变情况，结果发现：BRG1外显子25的PCR产物在第16例肺癌组织标本(T16)中比配对的正常肺组织标本(N16)缺失一条带(图2)；经测序证实，该例肺癌中BRG1基因的核苷酸序列在第3590位碱基有T→C的突变(图3)；相应的BRG1蛋白质序列第1171位氨基酸由Val(缬氨酸)→Ala(丙氨酸)，其位于BRG1最重要的功能区(依赖DNA的ATP酶区)，见图4。
　　2.3甲基化分析
　　我们曾用RT-PCR(reverse transcription.ooly-merase chain reaction)的方法，在6例肺癌组织和9株肿瘤细胞系中未检测到BRGl的mRNA表达，这是否由于BRG1启动子高甲基化所致有待证实，为此，对BRG1转录起始点上游1kh的DNA序列(CG含量>50％、CpG／GpC>50％)讲行甲基化分析，结果未发现甲基化异常(图5)，
　　
　　3讨论
　　
　　我们和其他人的研究均发现：在肺癌组织及多种肿瘤细胞系中，BRG1的mRNA与蛋白质表达下调或缺失，但影响BRG1在肺癌中表达下调的原因仍不清楚，值得进一步研究，肿瘤的发生是一个多基因、多步骤的复杂过程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活起到关键性的作用，已知抑癌基因可以通过突变或调控改变而失活。 突变包括基因的全部或部分缺失、基因的调控区发生变异而使其mRNA不表达、基因重排及错义、无义、移码或剪切位点的突变导致蛋白质失活等；基因调控改变有DNA甲基化、组蛋白乙酰化、剪接异常等，
　　Wong等为研究BRG1是否因突变而失活筛选了大量肿瘤细胞系，他们利用分散在BRG1中的6个STS(sequence tagged site)来检测92株肿瘤细胞系以判断是否存在纯合性缺失，结果发现BRG1在前列腺癌细胞系TSU-PRL和肺癌细胞系A-427中有羧基末端纯合性缺失，在肺癌细胞系NCI-H1299中有大片段缺失，他们采用全长cDNA分段测序的方法，发现在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌细胞系中，BRGl的外显子4、7、10、19、25、26、34有点突变和缺失造成的移码突变、无义突变、剪接位点改变等，这些突变影响了BRG1蛋白的表达和功能。
　　据此，我们用同样的6个STS对肺癌组织及肺癌、鼻咽癌等多种肿瘤细胞系进行纯合性缺失检测，并用PCR-SSCP对BRG1的上述7个外显子进行点突变检测，结果在所有检测的肺癌组织和肿瘤细胞系中未发现有BRG1的纯合性缺失，但在一例肺癌组织(1/18)中检测出有点突变，经测序发现，该例肺癌中BRG1基因的核苷酸序列在第3590位碱基有T―C的突变；相应地，BRG1蛋白质序列第1171位氨基酸由Val(缬氨酸)→Ala(丙氨酸)，突变点位于BRG1蛋白最重要的功能区(依赖DNA的ATP酶区)。
　　此外，考虑到BRG1表达下调可能是由于该基因启动子区DNA甲基化所致，我们采用酶切一PCR的方法，对已知BRG1表达下调或缺失的肺癌组织及肿瘤细胞系进行该基因的5′端CpG岛甲基化分析，但未发现有甲基化异常，表明BRG1的表达下调并非因为5′端DNA高甲基化所致，
　　最近的研究显示，分别采用PCR直接测序和甲基化特异性PCR(methylation.specific PCR，MSP)方法，对20例有19号染色体短臂杂合性丢失(19p LOH)的原发性非小细胞肺癌(NSCLC)标本(其中15例腺癌和5例鳞癌)进行突变检测和10株肺癌细胞系及52例肺癌组织进行DNA甲基化分析，结果发现：在所检测的肺癌组织和细胞系中，并无BRG1启动子的高甲基化；而在20例有19p LOH的原发性NSCLC标本中，则检测出一例肺腺癌(1/20)有BRG1外显子4内部24bp(第219-244位密码子)重复引起的插入突变和另一例肺腺癌(1/20)中BRGl外显子25第1160位密码子Gly(甘氨酸)→Arg(精氨酸)的点突变，这与我们的研究结果类似，由此可见BRG1突变在肺癌中确实存在，不过其频率较低；而肺癌中BRG1启动子并无甲基化异常表现，BRG1在肺癌中表达下调的机制尚需进一步分析。